Где собирают лада 4х4: На главном конвейере АВТОВАЗа тестируют сборку Нивы — журнал За рулем — Cheholshop.ru

Содержание

дилер LADA в г. Уфа

Лидеры российского рынка автострахования совместно с АВТОВАЗом запустили массовые программы доступно

«Ингосстрах», «АльфаСтрахование», «Согласие», «Росгосстрах» и «ВСК» запустили специальные программы «умного» страхования (основанное на данных о фактическом использовании или UBI) для автомобилей LADA, подключенных к телематической платформе LADA Connect. Проект направлен на развитие рынка добровольного страхования автомобилей массового сегмента. Первым участником программы станет самый продаваемый в России автомобиль – LADA Granta.Новые массовые программы UBI сделают страхование существенно доступнее. При покупке автомобилей, оснащенных LADA Connect, единоразовая дополнительная скидка на полис КАСКО составит 10%. Кроме того, владельцы «подключенных» автомобилей смогут получать дополнительную скидку при продлении договора страхования до 30% в зависимости от качества вождения (скоринг вождения выполняется автоматически на основе данных телематики LADA Connect).Оливье Морне, вице-президент по продажам и маркетингу марки LADA: «LADA Connect – это новый уровень сервиса и комфорта для наших клиентов. Интеграция технологий Connected Car на этапе производства выполняет еще и важную социальную функцию, повышая доступность добровольного страхования. «Умное» страхование позволяет заметно снизить стоимость полиса. До этого момента его развитие, особенно в массовом сегменте, осложнялось тем, что затраты на установку оборудования могли себе позволить не все автовладельцы и страховые компании. Мы решили данную проблему на системном уровне».Автомобили Granta, оснащенные LADA Connect, уже доступны к заказу в Москве и Московской области, Санкт-Петербурге, Самарской области, Татарстане и в Пермском крае, а в ближайшие месяцы – по всей официальной дилерской сети.Работа LADA Connect основана на техническом решении компании «Лаборатория умного вождения», часть которого – телематическая платформа со специальной системой страхового скоринга обрабатывает данные о вождении и с согласия автомобилиста передает их страховым компаниям. На основе этих данных формируются индивидуальные предложения.Директор по развитию ООО «Лаборатория Умного Вождения» Тимур Кузеев: «Запуск LADA Granta, оснащенных LADA Connect, – эпохальное событие для страхового рынка России. Мы совместно с АВТОВАЗом и лидерами нашего страхового рынка проделали серьезную работу и создали уникальный для массового сегмента продукт, учитывающий лучшие международные практики и опыт, который в перспективе нескольких лет может вывести нашу страну в мировые лидеры по количеству программ UBI. Это значительно повысит инвестиционную привлекательность нашего рынка для глобального автобизнеса».Индивидуализация страховых тарифов выполняет ряд важных общественно значимых функций. По мнению участников рынка, распространение UBI-программ приведет к заметному повышению безопасности движения, сделает страховые продукты доступными для начинающих водителей, прививая им ответственный подход к использованию автомобиля, снизит уровень страхового мошенничества и обеспечит доступ к КАСКО в массовом сегменте, изменяя отношение к страхованию в обществе.Член правления ПАО «Росгосстрах» Елена Белоусенко: «Запуск UBI-программ для LADA Granta, оборудованных LADA Connect, приведет к повышению устойчивости и стимулирует развитие российского рынка автострахования. Индивидуализация скоринга по характеру вождения, позволяет персонализировать оценку. На практике это означает, что для клиента отпадет необходимость платить за чужие риски, и мы сможем предлагать более доступные тарифы, которые сделают КАСКО привлекательным продуктом в массовом сегменте. Мы рады быть участником такого масштабного проекта и считаем, что именно «умное» страхование – это ключевой фактор формирования массового устойчивого страхового рынка».При пролонгации скидка за аккуратное вождение будет суммироваться со стандартным страховым коэффициентом бонус-малус, что снизит стоимость полиса для аккуратных водителей до 50%. Такое снижение цен, как ожидают страховщики, позволит заметно повысить проникновение добровольного автострахования в нашей стране.Директор по маркетингу АО «РН-Банк» Алла Кибизова: «РН Банк, как оператор программ страхования для брендов Альянса, в который входит бренд LADA, видит своей миссией предоставление максимального уровня сервиса клиентам Альянса. Запуск «умного» страхования, с одной стороны, позволит клиентам LADA получать более выгодные условия по страхованию от крупнейших страховщиков, а c другой – выступит драйвером для дальнейшего развития технологий «умного» страхования на российском рынке. Мы видим запуск такого масштабного проекта примером успешной коллаборации крупнейших игроков автомобильного и страхового рынков с целью создать уникальный продукт с высокой клиентской ценностью».Платформа LADA Connect работает по принципу «черного ящика», собирая данные, которые помогают восстанавливать обстоятельства ДТП. Это упрощает и существенно ускоряет процедуру страхового урегулирования, позволяя для удобства автомобилистов частично автоматизировать бюрократические процедуры и переносить их в онлайн. Кроме того, за счет интеграции этой технологии у автовладельцев появится возможность урегулировать убытки без предоставления справок из компетентных органов по событиям, зафиксированным платформой LADA Connect.Заместитель генерального директора по розничному бизнесу СПАО «Ингосстрах» Алексей Власов: «Мы активно работаем с «умными» программами с 2015 года, но их доля в структуре нашего портфеля пока невелика. Причина в достаточно высоких операционных расходах на само оборудование, его установку и подписку на информационный обмен. При этом выгоды таких программ очевидны для нашей компании как в части сбора скоринговых данных и возможности контроля убытков, так и в части развития продуктового предложения «Ингосстраха». Мы крайне позитивно оцениваем внедрение Connected Car с телематическим функционалом от крупнейшего автопроизводителя в стране».Одним из преимуществ LADA Connect является пересекающаяся интеграция данных, которая создает единую экосистему коммуникации между партнерами и участниками проекта. Например, автовладелец сразу после оформления договора страхования сможет видеть условия страховой программы в мобильном приложении LADA Connect. Там же он сможет отслеживать свой текущий скоринговый балл для скидки на пролонгацию.Руководитель практики Affinity ООО «Страховой Брокер Виллис СНГ» Аррожейро Элдер Жорж Мартинью и Генеральный директор ООО «АСТ» (генеральный партнер Willis Towers Watson по розничному автострахованию в России) Каро Карапетян: «Оформление договоров страхования в дилерских центрах LADA реализуется через централизованную IT-систему выпуска полисов, разработанную партнером RCI Group (АО «РН-Банк» — банк Альянса Renault-Nissan-Mitsubishi) международным брокером Willis Towers Watson (NASDAQ: WLTW), внедренную и обслуживаемую совместно с ООО «АСТ». Это позволяет оптимизировать процесс работы со страховой документацией в одной системе, а также вести единую отчетность со страховщиками. Процесс полностью автоматизирован для дилеров и автопроизводителя, что значительно упрощает процесс работы и управления. Внедрение «умных» программ позволит реализовать дополнительную сервисную поддержку для Клиентов и значительно упростит сопровождение при наступлении страховых случаев».Мировая практика развития «умного» страхования предполагает два пути. Первый – интеграция телематических решений страховыми компаниями, которые продают или дают в аренду «черные ящики» автовладельцам на время действия полиса. Второй – формирование страхового продукта на основе данных, собираемых системой, интегрированной на этапе производства. Второй подход привел к бурному росту «умного» страхования в ЕС, США и Китае в последние годы. В России в силу низкого проникновения добровольного автострахования и исторических особенностей рынка первый путь оказался неэффективен. На этом фоне интеграция телематических систем такими крупными производителями, как АВТОВАЗ, будет стимулировать рынок и повлечет за собой существенный рост проникновения не только «умного» КАСКО, но и добровольного автострахования в целом.Заместитель генерального директора по развитию бизнеса ВСК Ольга Сорокина: «Мы рады старту нового проекта с АВТОВАЗом. Недавно мы обновили программу «Умное КАСКО» для удобства потребителей, оптимизировав внутренние процессы компании с интеграцией оператора телематики. Запуск серийного производства автомобилей LADA с телематической платформой Connected Car позволит реализовать специальные страховые программы и предложить новые возможности для наших клиентов. Благодаря проекту аккуратным водителям будут доступны более персонифицированные условия страхования по КАСКО, дополнительная скидка на страховку автомобиля».По данным ЦБ в 2020 году проникновение КАСКО к ОСАГО в России составило 9,6%. Это очень скромный по мировым меркам результат. Для сравнения, в ЕС этот показатель достигает 78%. Распространение «умного» страхования в массовом сегменте рынка позволит увеличить его, не повышая убытки страховых компаний, что в перспективе может привести к еще большей доступности добровольного страхования.Директор департамента андеррайтинга автострахования АО «АльфаСтрахование» Илья Григорьев: «Наша компания стратегически нацелена на развитие современных программ и технологий, позволяющих улучшать качество клиентского сервиса и портфеля. Благодаря запуску LADA Granta, оснащенных LADA Connect, мы видим большие возможности синергии использования сервисов Connected Car и потенциал для развития современных страховых программ».Лежащая в основе принципа работы «умного» страхования индивидуализация страхового предложения происходит на основе данных о фактическом вождении – сколько и где автомобиль ездит, как часто водитель нарушает правила, превышает скорость или совершает опасные маневры. Сбор этих данных происходит тремя путями: через так называемые «черные ящики» – стационарно установленные в авто подключенные к сети интернет-устройства с акселерометром и GPS/ГЛОНАСС чипом, через мобильные приложения или простые GPS-трекеры. АВТОВАЗ пошел по самому технологичному и перспективному пути, выбрав для своих автомобилей продвинутую «подключенную» систему, которые в мировой практике пока редко применяется при производстве автомобилей массового сегмента.Андрей Ковалев, Директор по розничному андеррайтингу и партнерским продажам страховой компании «Согласие»: «ООО «Согласие» является партнером LADA Страхование с момента запуска программ от автопроизводителя в партнерстве с АО «РН-Банк». Мы следили за ходом реализации проекта и ждали запуск LADA Granta, оснащенных LADA Connect. Функционал автомобиля и телематической платформы позволяет нам вести контроль статистики и убытков в режиме онлайн. В наших планах наращивать продажи специальных программ для «подключенных автомобилей» — это позволит вывести управление продуктами на новый современный уровень и предложить для наших клиентов новые сервисные возможности».LADA Connect позволяет владельцу удаленно управлять функциями автомобиля при помощи смартфона, а также получать статистическую информацию об использовании автомобиля, которая помогает контролировать эксплуатационные расходы и вести удаленную коммуникацию с дилерскими центрами LADA и Автопроизводителем.Генеральный директор «Лаборатории Умного Вождения» Михаил Анохин: «Создание современной цифровой экосистемы вокруг автомобилей LADA открывает новые возможности для автовладельцев и связанных с автомобилями бизнесов. Запуск программ доступного UBI-страхования стало одним из первых подобных решений. Надеюсь, что наши совместные разработки послужат надежным связующим звеном между страховыми компаниями и автомобилистами и это позволит покупателям LADA получить самый доступный и удобный страховой продукт на рынке».***Контакты PR-Служб:АО «АВТОВАЗ» — (8482) 75-77-15, +7 (499) 263-08-50, e-mail: [email protected]ПАО «СК «РОСГОССТРАХ» — Бирюков Андрей Аскольдович (Andrey Biryukov), Руководитель блока PR ПАО «СК «РОСГОССТРАХ», Моб.: +7-910-404-94-56, e-mail: [email protected]СПАО «Ингосстрах» — Людмила Мегаворян, Пресс-секретарь, Моб.: +7 915 402 02 10, [email protected]САО «ВСК» — Ларин Павел, Руководитель направления по связям с общественностьюДепартамент маркетинговых коммуникаций и PR, Блок развития бизнеса, Тел.: +7 (495) 7274444, доб. 2962, Моб.: +7 926 503-17-00, [email protected]ООО «СК «Согласие» — Елена Григорьева, Моб.: +7 903 599 35 59, Олеся Карпова, Моб.: +7 926 911 00 38, e-mail: [email protected]АО «АльфаСтрахование» — Карцева Мария, Руководитель PR-Службы АО «АльфаСтрахование», Моб.: +7 962 923-74-49, e-mail: [email protected]ООО «АСТ» — Наталья Дегтярева, Директор по маркетингу и развитию, Моб.: +7-903- 100-45-72, e-mail: [email protected]ООО «Лаборатория Умного Вождения» — Александр Корольков, +7-915-497-65-75, e-mail: [email protected]***Группа »АВТОВАЗ» является частью бизнес-подразделения Dacia-LADA в структуре Groupe Renault. Компания производит автомобили по полному производственному циклу и комплектующие для 2-х брендов: LADA и Renault. Производственные мощности АВТОВАЗа расположены в Тольятти – АО »АВТОВАЗ”, ОАО “LADA Запад Тольятти”, а также в Ижевске – ООО »LADA Ижевск». Продукция марки LADA представлена в сегментах В, B+, SUV и LCV и состоит из 5 семейств моделей: Vesta, XRAY, Largus, Granta и Niva. Бренд лидирует на российском автомобильном рынке с долей более 20% и представлен в более чем 20 странах. LADA имеет самую большую официальную дилерскую сеть в России – 300 дилерских центров.ПАО СК «Росгосстрах» — флагман отечественного рынка страхования. На территории Российской Федерации действуют около 1 500 офисов и представительств компании, порядка 300 центров и пунктов урегулирования убытков. В компании работает около 50 тысяч сотрудников и страховых агентов. «Росгосстрах» входит в Группу «Открытие» — один из крупнейших финансовых холдингов нашей страны, и является стратегическим провайдером страховых продуктов и услуг в компаниях группы «Открытие».СПАО «Ингосстрах» — работает на международном и внутреннем рынках с 1947 года, занимает лидирующие позиции среди российских страховых компаний.«Ингосстрах» имеет право осуществлять все виды имущественного страхования, добровольное медицинское страхование и страхование от несчастных случаев и болезней, установленные ст.32.9 Закона РФ «Об организации страхового дела в Российской Федерации», а также перестраховочную деятельность. Компания присутствует в 251 населенном пункте РФ. Представительства и дочерние компании страховщика работают в странах дальнего и ближнего зарубежья.Страховой Дом ВСК (САО «ВСК») работает с 1992 года и является универсальной страховой компанией, предоставляющей услуги физическим и юридическим лицам на всей территории России. Компания стабильно входит в ТОП-10 страховщиков страны по сборам в основных сегментах страхового рынка – автостраховании, страховании от несчастных случаев и болезней (НС) и добровольном медицинском страховании (ДМС). На сегодняшний день более 30 млн человек и 500 тысяч организаций воспользовались продуктами и услугами ВСК. Региональная сеть компании насчитывает свыше 500 офисов во всех субъектах России, что дает возможность эффективно сопровождать договоры страхования по всей стране.ООО «СК «Согласие» входит в единую страховую группу с ООО «Согласие-Вита» и успешно ведет свою деятельность на страховом рынке уже более 27 лет. Внутренняя политика Компании позволяет нам уверенно удерживать высокие позиции на страховом рынке и ежегодно увеличивать число страхователей.Группа «АльфаСтрахование» – крупнейшая частная российская страховая группа с универсальным портфелем страховых услуг, который включает как комплексные программы защиты интересов бизнеса, так и широкий спектр страховых продуктов для частных лиц. Услугами «АльфаСтрахование» пользуются более 31 млн человек и свыше 106 тыс. предприятий. Региональная сеть насчитывает 270 филиалов и отделений по всей стране. Надежность и финансовую устойчивость компании подтверждают рейтинги ведущих международных и российских рейтинговых агентств: «ВВ+» по шкале Fitch Ratings, «ВВB-» по шкале S&P и «ruАAA» по шкале «Эксперт РА» и «ААА ru» по шкале «Национального рейтингового агентства».«РН-БАНК» – «Банк Альянса Renault-Nissan-Mitsubishi». Почти вековая история Банковской Группы Рено берет свое начало в 1924 году во Франции. Сейчас Группа представлена в 36 странах мира, а на российском рынке оказывает поддержку клиентам, выбирающим продукцию брендов Альянса, с 2006 года. Приоритетными направлениями деятельности Банка являются: кредитование физических лиц на приобретение автомобилей брендов Альянса, финансирование дилеров брендов Альянса, а также оказание клиентам сопутствующих финансовых услуг. По состоянию на конец 1 квартала 2021 года Банк занимает 52 место по размеру активов среди российских банков по версии Интерфакс, поднявшись на 6 позиций за 15 месяцев.Willis Towers Watson — ведущая международная консалтинговая и брокерская компания, разрабатывающая современные бизнес-решения, которые помогают нашим клиентам по всему миру преобразовывать риски в возможности развития и роста. Наша компания была основана в 1828 г., и в настоящее время насчитывает 45 000 сотрудников, предоставляющих услуги для более чем 140 стран и рынков.«Страховые брокеры «АСТ» — являются одним из ведущих страховых брокеров, оказывающих полный спектр страховых брокерских услуг и услуг в области риск консалтинга с 2007 года. ООО «Страховые брокеры «АСТ» оказывают страховые брокерские услуги по всем видам страхования, а также не противоречащие законодательству Российской Федерации сопутствующие консультационные услуги в области управления рисками.«Лаборатория умного вождения» – российский разработчик универсальной автомобильной телематической платформы и системы LADA Connect. Созданные в «Лаборатории умного вождения» аппаратно-программные решения превращают автомобиль в подключённое к сети Интернет устройство. Специалисты «Лаборатории умного вождения» оказывают адаптированный под каждого клиента набор услуг – от круглосуточного мониторинга состояния автомобиля и защиты от угона до анализа эксплуатационных параметров, контроля расходов и оценки безопасности вождения. Страховым компаниям решения «Лаборатории умного вождения» помогают провести селекцию страхового портфеля и сформировать индивидуальные страховые тарифы для клиентов. Автопроизводителям и автопаркам – внедрить инновационные подходы в бизнесе.Дополнительная информация:Группа «АВТОВАЗ» является частью бизнес-подразделения Dacia-LADA в структуре Groupe Renault. Компания производит автомобили по полному производственному циклу и комплектующие для 2-х брендов: LADA и Renault. Производственные мощности АВТОВАЗа расположены в Тольятти – АО «АВТОВАЗ”, ОАО “LADA Запад Тольятти”, а также в Ижевске – ООО «LADA Ижевск».Продукция марки LADA представлена в сегментах В, B+, SUV и LCV и состоит из 5 семейств моделей: Vesta, XRAY, Largus, Granta и Niva. Бренд лидирует на российском автомобильном рынке с долей более 20% и представлен в более чем 20 странах. LADA имеет самую большую официальную дилерскую сеть в России – 300 дилерских центров.

АвтоВАЗ объяснил прекращение выпуска Lada Priora :: Бизнес :: РБК

АвтоВАЗ в конце июля прекратит выпускать автомобиль Lada Priora. Решение было принято из-за низкого спроса на эти машины и растущего спроса на более новые модели компании

Фото: Андрей Холмов / РИА Новости

Выпуск автомобилей Lada Priora в Тольятти будет прекращен в конце июля. Об этом говорится в сообщении компании, поступившем в РБК.

По словам исполнительного вице-президента по продажам и маркетингу АвтоВАЗа Яна Птачека, в последние три года из-за выпуска нового поколения автомобилей, таких как Lada Vesta, Lada XRAY, покупатели продукции компании воспринимают бренд иначе. «А это, в свою очередь, ведет к снижению спроса на Lada Priora», — пояснил он.

Lada Priora была хорошим автомобилем «для своего времени», выпуск этой модели позволил АвтоВАЗу выжить десять лет назад, добавил он.

Выпуск Lada Priora АвтоВАЗ начал в 2007 году, несколько раз с тех пор изменив кузов и двигатель модели. Пик популярности автомобиля пришелся на 2011-й, когда производителю удалось реализовать за год 138 тыс. машин. Всего за десять лет было выпущено более 860 тыс. автомобилей.

В 2015 году АвтоВАЗ решил максимально снизить стоимость этой модели, чтобы «продлить ей жизнь», говорил представитель компании Сергей Ильинский, хотя до этого обсуждалось, что производство Lada Priora прекратят, чтобы отдать мощности под сборку Lada Vesta.

Сборочная линия №3, где собирали Priora, продолжит работу: на этой линии с прошлого года собирают также универсалы Lada 4×4 («Нива»), уточнили в АвтоВАЗе.

В Казахстане будут выпускать четыре модели LADA

Автозавод в Казахстане будет выпускать четыре модели LADA. Ранее на предприятии собирали только одну модель – LADA 4×4. Теперь к ней прибавятся Granta, Kalina и Priora.

Президент АВТОВАЗа Николя Мор посетил Казахстан с первым рабочим визитом, в ходе которого он ознакомился с работой автосборочного завода «АЗИЯ АВТО» в Усть-Каменогорске, сообщает пресс-служба АВТОВАЗа. Здесь налажен выпуск автомобиля LADA 4×4, а в ближайшие недели модельная линейка производимых автомобилей расширится – к ним прибавятся Granta, Kalina и Priora.

Президенту АВТОВАЗа также представили строительную площадку нового производства, где с начала 2016 года выполнена значительная часть работ по прокладке электрических сетей, обеспечению тепло- и водоснабжения, строительству подъездных путей. Ожидается, что это станет самым большим производством автомобилей LADA за пределами России.

Казахстан на сегодня является крупнейшим экспортным рынком LADA. Я благодарен властям республики за поддержку нашего совместного проекта

Николя Мор, президент АВТОВАЗа

Открытие новой производственной площадки запланировано на 2018 год. Предполагается, что объем выпуска составит до 60 тыс. автомобилей в год с возможностью дальнейшего расширения мощностей до 120 тыс. машин.

«Казахстан на сегодня является крупнейшим экспортным рынком LADA. Мы заинтересованы в скорейшей реализации совместных проектов, и с этой целью я намерен регулярно посещать площадку строящегося в Усть-Каменогорске производства. Я благодарен властям Республики Казахстан за поддержку нашего совместного проекта», – заявил президент АВТОВАЗа Николя Мор.

Напомним, что по итогам прошлого года АВТОВАЗ подтвердил свой статус наиболее успешного игрока на казахстанском автомобильном рынке. На долю LADA пришлось 28% продаж всех новых легковых автомобилей.

События, связанные с этим

27 мая 2016

В Казахстане будут выпускать четыре модели LADA

Подпишитесь на новости

Легендарному внедорожнику Lada 4×4 исполнилось 40 лет

Ровно 40 лет назад, 5 апреля 1977 года, в Тольятти начался серийный выпуск легендарной «Нивы» — ВАЗ-2121. За эти годы автомобиль без преувеличения получил всемирную известность, а его положительный образ у автовладельцев резко контрастирует с реноме самого «АвтоВАЗа». В общей сложности в Тольятти выпущено около 2,5 млн машин, которая сейчас называется Lada 4×4. К юбилею «АвтоВАЗ» подготовил спецверсию модели.

«Нива» — едва ли не главная гордость всего «АвтоВАЗа». Это не только 40-летняя история успеха и признания, но еще и первый оригинальный автомобиль, разработанный на заводе в Тольятти. На «АвтоВАЗе» не стесняются называть внедорожник «уникальной моделью, открывшей новую эру в истории полноприводных машин». И в данном случае такие громкие слова трудно назвать преувеличением.

Идея создания легкого внедорожника для жителей села родилась еще в конце 60-х годов у главного конструктора ВАЗа Владимира Соловьева. Подумать над новым сегментом инженерам предложил глава Совмина СССР Алексей Косыгин.

В 1972 году ведущим конструктором «Нивы» назначили Петра Прусова.

Примечательно, что свое название машина получила по первым буквам имен детей Соловьева и Прусова — Надежды, Ирины, Вадима и Андрея.

В 1974 году появились первые предсерийные образцы модели, ее активно тестировали в самых разных условиях и даже сравнивали по проходимости, в том числе с продукцией британской Land Rover.

Главная особенность «Нивы» — в ее новаторских даже по мировым меркам решениях. Автомобиль получил постоянный полный привод, несущий, полностью закрытый цельнометаллический кузов, независимую подвеску и при этом отлично сочетал в себе комфорт и компактные размеры городского автомобиля — все это на фоне относительно небольшой по западным меркам цены сильно выделяло автомобиль среди конкурентов и обрекало его на поистине мировое признание.

Фактически «Нива» стала родоначальником класса городских кроссоверов, огромного класса автомобилей, который начал быстро формироваться после появления вазовского внедорожника.

До старта серийного производства Владимир Соловьев, к сожалению, не дожил. Сойдя с конвейера 5 апреля 1977 года, автомобиль сразу стал активно экспортироваться, и в отдельные годы большая часть «Нив» (правда, далеко не в той комплектации, что продавалась в самом СССР) шла на экспорт.

Причем речь шла не только о странах третьего мира, но и о ведущих автомобильных державах, в том числе Японии. И во многих из них до сих пор действуют фан-клубы модели. Несколько лет назад корреспондент «Газеты.Ru» обнаружил припаркованную праворульную «Ниву» на улице небольшого австралийского городка в окрестностях Аделаиды. Автомобиль был в хорошем состоянии и, очевидно, активно использовался.

«Ниву» можно встретить в Гренландии и Исландии и ряде других весьма отдаленных от Тольятти регионов планеты — всего за рубеж было продано более полумиллиона автомобилей.

В общей сложности с конвейера сошло уже около 2,5 млн экземпляров «Нивы», которая с 2005 года официально называется Lada 4×4 (оригинальное название отошло к СП «GM-Автоваз», которое собирает другую внедорожную модель — Chevrolet Niva). В 2017 году «АвтоВАЗ» подготовил специальную версию кроссовера Lada 4×4 40 Anniversary, производство которой должно начаться в апреле. Среди ожидаемых изменений — новый дизайн колесных дисков, специальный шильдик на переднем крыле под стойкой лобового стекла, новая отделка салона и новые цвета окраски кузова. Техническая начинка останется прежней, сейчас кроссовер комплектуется 83-сильным мотором объемом 1,7 л с пятиступенчатой механикой.

Кроме того, к юбилею модели летом «АвтоВАЗ» проведет ряд мероприятий для клиентов.

Одним из обладателей «Нивы» является президент России Владимир Путин, который приобрел ее в 2009 году.

Примечательно, что публично о покупке Путин, занимавший тогда пост премьер-министра, впервые рассказал в Тольятти во время встречи с рабочими завода в марте того же года.

Отвечая на вопрос, какой отечественный автомобиль он хотел бы приобрести для себя, он сообщил, что это «Нива». «У меня уже есть, скоро оформлю», — заявил премьер.

Позже оказалось, что Путин приобрел не обычную Lada 4×4, а спецверсию «Джунгли», которая довольно сильно отличается от стандартной комплектации. У президентского кроссовера стоит более мощный мотор объемом 1,9 л и мощностью 140 л.с., видоизменены коробка передач, раздаточный блок, подвеска, усилен задний мост и полуоси. Кроме того, автомобиль оснащен «кенгурятником» и лебедкой. Путин лично представил покупку в мае 2009 года, неожиданно приехав на ней на встречу с турецким премьером.

«Это специальная комплектация. Но не для меня лично,

а они именно в такой комплектации выпускаются серийно, — рассказывал журналистам Путин о своем автомобиле. — Здесь в данном случае резина немного улучшенная». Автомобиль вызвал большой интерес у журналистов, и Путин даже позволил нескольким из них лично протестировать «Джунгли».

С тех пор президент регулярно указывает автомобиль в своей декларации о доходах.

Как АВТОВАЗ обновляет производство

Большой объем работ по модернизированию производства на АВТОВАЗе был выполнен в 2019-м году. Результатом такой работы стал не только усиленный контроль качества, но еще и оптимизация производственных процессов, и улучшение для персонала условий работы, и экономия средств. Процесс повышения эффективности производства осуществляется согласно методикам Альянса «Рено-Ниссан», полноправным участником которого является и АВТОВАЗ. Причем сегодня Альянс представляет собой международный производственный комплекс, выпускающий легковые авто, которые соответствуют актуальным требованиям покупателей, а также поставляющий автокомпоненты, необходимые для выпускающихся Альянсом в России и за границей автомобилей.

Основные работы по модернизации в 2019-м году были выполнены на сборочной линии Лада Гранта. В частности, за счет перестройки производственных потоков удалось уменьшить общую длину линии на 560 метров. Одновременно с этим в потоке было уменьшено количество собираемых машин. Как результат качество автомобилей существенно повысилось. Отдельно на конвейере организовали работу участков, где формируются кит-комплекты. Также сократилось число задействованных на линии погрузчиков. Причем теперь для доставки автокомплектующих к сборочным постам теперь доставляют в автоматизированном режиме с помощью восьми роботизированных тележек. Благодаря такому нововведению ритм поставок улучшился на 23%.

Используемый на АВТОВАЗе принцип сборки, предусматривает, что набор автокомпонентов теперь формируется согласно с моделью будущего авто и его комплектацией. Данный набор автокомпонентов доставляют тележки-роботы, которые работают синхронно с конвейером. Доставка осуществляется от зоны формирования соответствующего кит-комплекта. На сборочном посте рабочие устанавливают доставленные детали на необходимый кузов согласно с утвержденной программой сборки.

Производственная линия В0 в рамках модернизации получила дополнительно восемь роботов, которые не только сваривают наиболее важные точки основания и каркаса кузовов автомобилей, но и могут фиксировать геометрические параметры машины. За счет роботизации, а также более стабильного выполнения операций, производителю удалось повысить уровень эффективности работы сварочного участка линии В0. Как отмечают в пресс-центре компании, на линии, где сваривается основание кузовов кроссоверов LADA XRAY и автомобилей семейства LADA Largus сейчас задействовано 13 роботов. Данную линию АВТОВАЗ продолжит модернизацию этого производства и в 2020-м году. Среди прочего на линии на участке сварки в строй планируют ввести два новых робота.

На третьей нитке вазовского конвейера, где собирают вседорожники ЛАДА 4х4, провели модернизацию грузонесущего конвейера по подаче комплектующих. Также здесь внедрили три так называемых транспортных кольца, загрузка которых ведется из одной зоны. Наборы автокомпонентов теперь подаются непосредственно в рабочие зоны операторов.

Михаил Рябов, занимающий сейчас пост исполнительного вице-президента по вопросам производства и управления цепочкой поставок, отметил, что АВТОВАЗ, как часть международной компании, перенимает у партнеров самые лучшие в мире практики. Они успешно внедряются в производстве и логистике, а также в оценке качества машин. Одновременно с этим на заводах Альянса весьма востребованы компетенции, имеющиеся у вазовских сотрудников. Подобная синергия оказывает положительное влияние на все стороны, а именно на АВТОВАЗ, на коллектив компании, а также на покупателей автомобилей ЛАДА.

LADA Priora теперь собирают на новом конвейере

В среду, 29 января, АВТОВАЗ возобновил выпуск LADA Priora на модернизированной линии главного конвейера.

Сборка «Приоры» переведена со второй линии главного конвейера на третью, которая была реконструирована. Цель модернизации – создать современный сборочный комплекс с универсальным оборудованием, отвечающий требованиям альянса Renault-Nissan, сообщает пресс-центр АВТОВАЗа.

В ходе первого этапа модернизации проведена замена подвесок, полов, освещения, изменены маршруты и высоты основного и вспомогательных конвейеров под новые габариты подвески и технологию сборки на основе стандартов AIMS, введена в строй линия перегрузки кузовов с окрасочных подвесок на сборочные. Также оптимизировано расположение рабочих мест, улучшено электроснабжение и повышена надежность работы оборудования. Система управления производством аналогична действующей технологии по сборке автомобилей на платформе В0. Все это должно положительно сказаться на качестве автомобилей, уверены на заводе.

Сборка LADA Priora начата в пусконаладочном режиме. В начале февраля планируется достичь темпа сборки 25 автомобилей в час, затем темп будет наращиваться вплоть до максимального – 60 автомобилей в час.

После завершении всех этапов модернизации на третьей линии можно будет собирать не только автомобили LADA Priora, но и перспективные автомобили LADA на универсальной платформе В/С и автомобили на платформе В0.

Вторая линия главного конвейера, где до декабря 2013 года собиралась LADA Priora, будет демонтирована, на ее месте будут располагаться участки сборки модулей и разменные площади.

Производственные мощности АВТОВАЗа в Тольятти представлены следующими сборочными линиями:

Конвейер сборки автомобилей на платформе «В0» — здесь собираются LADA Largus, Nissan Almera, идет подготовка к выпуску автомобилей Renault;
Универсальная сборочная линия главного конвейера — здесь собираются LADA Priora, идет подготовка к выпуску автомобиля LADA на платформе В/С;
Конвейер сборки автомобилей LADA Granta и LADA Kalina. Ведется подготовка к выпуску автомобилей Datsun;
Линия сборки LADA 4х4;
Конвейер опытно-промышленного производства — здесь выпускаются длиннобазовая LADA 4х4 и LADA Priora Coupe.

Самые нелепые названия автомобилей — marya_iskysnica — LiveJournal

Выбрать подходящее имя для автомобиля задача непростая: от названия напрямую зависит объем продаж в той или иной стране. Неймингу в автоиндустрии уделяется большое внимание. Ведь недаром народная мудрость гласит: ‘Как вы лодку назовете, так она и поплывет’…

Если раньше названия были все больше идейные, то сегодня они чаще всего генерируются компьютерами. Avensis, Elantra, Magentis, Megane, Meriva, Mondeo, Vectra, Vitara – все эти названия были придуманы машинами. Впрочем, некоторые производители случайные названия выстраивают в закономерность.

Например, известно, что Opel старается, чтобы каждая новая модель в своем названии заканчивалась на звук “А”, а для звучности в центре желателен “Р”. Таким образом, модельный ряд Opel звучит весьма “рычно”: Astra, Corsa, Vectra, Tigra, Frontera, Meriva и т.д. А Citroen в свое время делал так, чтобы автомобили носили женские имена со звуком “С”: Xsara, Xantia и пр. Со временем все это упростилось до С1, С2, С3, С4, С5 и т.д.

Opel Ascona. И на немца бывает проруха. На севере Испании и в некоторых частях Португалии слово ‘ascona’ означает женские половые органы.

В своем стремлении “не заморачиваться” некоторые доходят до абсолютной упрощенности. Например, согласно последней концепции Mazda, машины у нее теперь именуются очень просто: 1, 2, 3, 4, 5, 6 и т.д. Ну а другие так “наворотят”, что человек непосвященный никогда не догадается, какую идею производитель законсервировал в названии. Например, в названии Suzuki SX4, по задумке производителя, воплощена перекрестная концепция, где “S” означает “спорт”, “X” – знак перекрестной концепции, “4” означает 4 времени года, а также цифра относит к приводу 4×4.

Российские представительства не участвуют в номинации моделей, но иногда адаптируют названия иномарок для российского рынка. Как рассказали в представительстве Mazda, процедура следующая: в головном офисе составляется список возможных названий, которые обычно являются японскими словами (они многозначные, так что там поле для деятельности большое). Этот список рассылается по различным странам с просьбой прокомментировать звучание на местном языке. Полученные комментарии собирают в одну таблицу и на их основе выбирают название. Делается это не случайно: нередки случаи, когда оригинальное название на чужом языке означает что-либо нецензурное.

Самый известный случай, когда название авто сыграло плохую шутку с производителем, – это вывод внедорожника Mitsubishi Pajero на рынки Латинской Америки и Испании. Японские маркетологи не сразу осознали, что в испаноязычных странах название Pajero (по-испански читается “пахеро”) означает не что иное, как “онанист”. Пришлось срочно переименовывать машину в Montero.

Mitsubishi Pajero. Когда японцы выбрали такое название, ничего такого не имелось в виду. Кто же знал, что аргентинская дикая лесная кошка leopardus pajeros, в честь которой и названа модель, не совсем то, с чем ассоциируется слово Pajero.

Для россиян, например, неблагозвучными стали бы названия VW Lupo или Proton Perdana, не случайно Chevrolet предпочел Daewoo Kalos в России переименовать в Chevrolet Aveo. “До появления российского офиса были и “смешные” для русского уха называния, как Mazda Sassou – рассказывает PR-директор представительства Mazda – Теперь, когда мы включены в процесс, названия уже нейтральны”.

Самое большое поле для творчества открывается для китайских дистрибьюторов: вместо непонятных иероглифов они вправе придумывать названия, какие захотят. Что касается отечественных автомобилей, Россия уже долгое время избавлена от каких бы то ни было проблем творческого характера. В 1968 году через газету “Советская Россия” ВАЗ объявил конкурс на лучшее название для советского народного автомобиля.

‘АвтоВаз’ по количеству и содержанию промахов с названиями соперничает с японскими производителями. Название Lada Kalina, в которой русское ухо не слышит ничего предосудительного, пришлось менять для Финляндии на Lada 118 и Lada 119. Дело в том, что на финском ‘kalina’ означает ‘треск’, ‘дребезжание’, ‘грохот’. То есть производитель как будто намекает…

Характерно, что в то время процесс номинации происходил по принципу “даздраперма”. Слава богу, удалось избежать таких названий, как “Сотая весна”, “Десина” (сокращенно от Детище советского и итальянского народов) или “ВИЛ -100” (столетие Владимира Ильича Ленина). Хотя, с другой стороны, названия LADA GAGARIN, LADA GENIY, LADA ILYCH сегодня бы звучали вполне динамично.

Вот LADA UTES – это уже… символично, пожалуй. А название VALENTINA, скорее всего, дало бы толчок для развития устного народного творчества (“Гони! Гони, Валентина, гони! Ты видишь, Валя, я совсем не боюсь…”). Если бы это название пришлось по сердцу первому гендиректору ВАЗа Виктору Полякову, сегодня на дорогах, скорее всего, ездили бы не “Лады”, а “валечки”, “вальки”, “валюхи”, “развалюхи” и т.д.

Fiat Punto. Итальянцы тоже сели в калошу, причем опять среди испаноязычных клиентов. На языке вечно недовольных названиями испанцев ‘punto’ означает не только ‘точка’ (как в итальянском), но и ‘мужское достоинство невероятно скромных размеров’.

Любопытные подробности: среди других названий, предлагавшихся пролетариатом для автомобиля, позже ставшего известным как “Жигули”, были: “Пато” (Пальмиро Тольятти), “Орленок”, “Волжанка”, “Жигулевская волна”, “Ульяновец”, “Венера”. Многие желали отразить дружбу советского и итальянского народов: “Россита”, “Дружба”, “Союз”, “Софи”, “Итарос”, “Пальмиро”, “Совиталь”. Немало было “космических” предложений: “Восток”, “Лунник”, “Спутник”, “Комета”, “Заря”. Были и просто ласковые имена: “Жаворонок”, “Россиянка”, “Ласточка”, “Мечта”, “Друг”, “Песня”… Гм.

В конце концов машину решено было назвать “Жигули”, что в то время тоже звучало довольно экзотично, а для экспорта это название и вовсе не подошло. В нескольких языках оно имело не очень приличные созвучия. В этом смысле особенно отличился венгерский язык, в котором есть выражение “щикули” с абсолютно нецензурным переводом, в других языках “Жигули” напоминали понятие “жиголо”. В итоге уже в 1975 году все экспортные ВАЗы были переименованы в LADA, в России “Жигули” стали называться LADA-ми только начиная с 2004 года.

Chevrolet Nova. Автомобиль Chevrolet Nova удачно продавался во многие страны, однако вновь проблемы возникли с испаноязычными автолюбителями. Название ‘Nova’ можно перевести как ‘не едет’. Не удивительно, что, если шевроле не едет, его не купят.

Mazda LaPuta. Другие японцы, на этот раз из Mazda, удивили испанцев моделью, названной в честь мифического летающего острова, — LaPuta. Испанцы про остров ничего не поняли и модель закупать не стали: кто же станет ездить на машине, которая в переводе на испанский называется женщиной легкого поведения в самом непотребном смысле?

Общие сведения о ладах и износе ладов

Рис. 1. Измерение лада на ширину короны (А) и высота (B), а также размер зазубрины (C) и глубиной хвостовик (D).
Рис. 2. Вмятины и ямки на ладу. Причины. проблемы с интонацией, создает дребезжание струн, препятствует плавным изгибам струны.
Рис.3. Плоский лад также создает хрип и интонацию. проблемы.
Рис. 4. Восстановление лада с помощью специализированный инструмент.
Фиг.5. Полный перерыв. дает гитаре новую жизнь.

От состояния ваших ладов будет зависеть как хорошо играет твоя гитара. Каждый раз, когда вы прижимаете струны к лады, трение между ними тонко изменяет форму ладов, вызывая их изнашивать. Со временем этот контакт металла с металлом может привести к образованию струны. дребезжание и интонация. Величайший повреждение ладов вызвано капо, особенно под простые струны.

Износ ладов является обычным побочным продуктом играть на вашем инструменте.Как гитарист это важно уметь оценивать лад Повреди и пойми какие варианты ты надо это исправить. Большой вопрос, может ли Я ремонтирую лады или пора заменить их? Давайте исследуем тему, начиная с сам провод.

Из чего сделаны лады? Хотя на ладони часто называют «никелевым серебром», это не на самом деле содержат серебро. Скорее, это обычно состоит из 18 процентов никеля, 80 процентов медь и небольшое количество других материалы, такие как цинк, свинец и кадмий.Действительно Хорошая проволока для ладов содержит больше цинка и меньше меди. Один из моих любимых брендов — Jescar, и их Формула NS — 62 процента меди, 18 процентов. никель и 20 процентов цинка. Потому что это сложнее чем традиционный лад, он служит дольше.

Другой вариант — нержавеющая сталь. Нержавеющая со сталью очень сложно работать, но она длится значительно дольше, чем традиционные ладонь. Однако лады из нержавеющей стали бывают с здоровенным ценником. Большинство мастеров заряжать более чем вдвое, чтобы перезарядить гитару нержавеющей сталью, потому что она почти разрушает их инструменты и работа занимает намного больше времени сделать.В конечном итоге это может быть идеальный решение для вашей гитары, так как вы можете больше никогда не придется менять лады!

Каковы размеры ладов? Fretwire входит в разнообразие размеров и форм. Рис. 1 иллюстрирует четыре элемента, которые определяют конкретный стиль ладов. Они шириной и высота короны , размер зубца , и глубина хвостовика .

Заводная головка — это открытая часть беспокойствоКогда вы трогаете ноту, вы нажимаете шнурок до самого верха короны. Как ряд крючков, зубцов прикрепляют лад к гриф. Ширина зазубрины определяет ширину лада и тангажа определяет глубина ладовой прорези, т. е. насколько далеко лада проникает в гриф.

Размер и форма каждого из них четыре элемента специально разработаны для разных игровых предпочтений и типов гитары. Ширина короны может варьироваться от от сверхузкого (0,053 дюйма) до сверхвысокого размера (.118 дюймов). Высота лада может быть любой. от короткого 0,032 дюйма до высокого 0,060 дюйма. В ширина зубцов и глубина хвостовика также варьируются от 0,019 дюйма до 0,040 дюйма.

Все эти размеры имеют конкретное назначение и являются важными соображениями, когда выбирая лады. Например, более широкие лады могут производить более сильный тон, но поскольку они износ, интонация гитары «смещается» дальше чем с узкими ладами. Но узкая проволока имеет его недостатки тоже: узкие лады не вызывают ваша интонация так сильно дрейфует, но они изнашиваются быстрее широких ладов.

Высокие лады прослужат дольше, чем они потребуются. подлежит замене. Однако я не рекомендую их для тех, кто играет с крепкий хват. Если крепко сжимать шею во время игры или использования каподастра струны будут тяните резко во время игры. С другой стороны, более короткие лады изнашиваются быстрее (особенно если вы используете каподастр) и его нужно заменить чаще.

Размер зазубрины и хвостовика сильное воздействие на гриф гитары, и если вы решили установить новые лады, это очень важно использовать правильный размер.Если зазубрины и хвост слишком узкие или мелкие для прорезей лады не будут надежно сидеть в грифе. Это заставляет их поднимать выходить, когда погода меняется и дает неровные лады и много шумных или мертвых Примечания. Когда зазубрины и запах тоже широкие, они могут треснуть и расколоть гриф, или даже заставить шею изгибаться назад. В случае заднего лука вам придется повторно ладить гитара.

Подведем итог: шея должна иметь лады правильного размера, подходящие под размер грифа и игрок.В противном случае вы получите очень дорогой бардак!

Можно ли отремонтировать вмятины на ладах? Вмятины всегда создают проблемы с ладами. Но означает ли обнаружение вмятин, что вам нужно заменить лады или перекроить вариант?

Это может произойти в любом случае, и ответ зависит от глубины вмятины. Когда вмятины глубокие, ваша техника должна быть удалите слишком много материала с все лады правильно отремонтировать проблемные. Когда высота ладов ниже.038 «и это имеет глубокие ямки и вмятины, шансы повторного лада в порядке.

Посмотрите на Рис. 2 и обратите внимание на глубокие ямки. в этих ладах. Эти вмятины слишком глубоки, чтобы ремонт, поэтому лады необходимо заменить.

Вмятины и ямки — не единственная причина заменить лады. Плоские пятна на ладьях еще один виновник. Чтобы лад работал правильно, у него должна быть куполообразная корона. Если корона плоская, как в Рис. 3 , это приведет к тому, что дребезжание и интонация. Как вмятины и ямки, если лад имеет плоскую коронку и слишком короткий, его нужно будет заменить.

Если лады достаточно высокие, чтобы их можно было отремонтировать, они сначала выравниваются, а затем повторно увенчаются. Чтобы уравновесить раздражение, ваша техника измельчает и пескоструит лады на одинаковую высоту. Это оставляет лады с плоской коронкой. Следующий шаг состоит в том, чтобы заново увенчать лад, удалив материал с его сторон, пока корона не предложит узкое место контакта струны Рис. 4 . Это очень кропотливый процесс, и требуются годы практики для разработки правильного навыки — определенно работа для профессионала.

Что означает перезарядка? В новом ладу, заменены все лады в грифе.Процесс очень точный и требует дорогие инструменты и большое мастерство. Базовый шаги включают разборку гитары, удаление всех старых ладов, строгание грифа, закругление грифа, очистка прорези для ладов, установка новых ладов и затем выравнивание и повторная коронка, чистка грифа и полировки ладов, и, наконец, сборка гитары Рис. 5 .

И это лишь базовый обзор процесс. Есть еще много, еще много шагов — достаточно, чтобы заполнить всю книгу.Перетяжка — дело дорогое и трудоемкое, но в целом стоит своих денег.

На протяжении многих лет у меня были клиенты, которые заменить старую шейку с болтовым креплением на новый, вместо того, чтобы делать выбор в пользу повторения лада. Это может быть отличным выбором, но будьте осторожны — почти каждый новый гриф требует уровня лада. и коронация. Большинство заводов по производству гитарных деталей не тратьте время на то, чтобы мастер убедитесь, что лады выровнены. Так что оставайся в помните, что к тому времени, когда вы заплатите за новый шею и дополнительную резьбу, вы могли переработали оригинальную шею и некоторые остатки сдачи!

А как насчет частичного рефрета? Иногда просто заменяя несколько ладов, а не все они, выполняет свою работу.Обычно это предпочтительнее для шеи, есть износ только на первых шести или семи ладах и имеет ровный гриф. Если гриф в хорошем состоянии и остальные лады достаточно высоки, частичный рефрет — отличный способ сэкономить деньги. Не все гитары подходят для этой операции. Если на грифе есть крутите или махайте в нем, требуется полный перебор ладов.

Capo — это четырехбуквенное слово. Каподастр злейший враг раздражения. Конечно я люблю капо, потому что я люблю лепить! Если нет один использовал капо, мой доход от лепнины упадет как минимум на 60 процентов.Чем больше вы используете каподастр, тем больше вреда он наносит лады. Когда каподастр сжимает струны, он разбивает струны о лады и намного сложнее, чем если бы вы играли аккорд. В результате лады начинают сплющиваться и образовывать ямки и вмятины. Это здорово новости для гитарного техника, но не очень хорошие для игрок.

Чтобы избежать ненужного «наложения капо» повреждение ладони, я предлагаю вам использовать каподастр с регулировка натяжения. Многие капо просто прижать струны к грифу не предлагая способа отрегулировать натяжение.Если вы используете каподастр с натяжением регулировки, вы можете зажать устройство с помощью достаточно силы, чтобы предотвратить дребезжание струн, еще уменьшить дополнительный износ ладов.

Еще одно большое преимущество использования каподастра с регулируемым натяжением зажима: помочь избежать проблем с настройкой по сравнению с нерегулируемым капо. Есть несколько отличных капо на рынке, которые уменьшат беспокойство повреждения и проблемы с настройкой, в том числе Planet Waves Dual Action Capo и все такое различные модели Шубба. Если ваш каподастр не предлагает регулировку натяжения, купить тот, который делает.Это сэкономит вам массу деньги в резьбе.

Джон Леван, гитарный техник в Нэшвилле, написал пять книг по ремонту гитар, все опубликовано Мел Бэй. Его бестселлер, гитара Уход, установка и обслуживание , подробно гид с нападающим Бобом Тейлором. Леван приветствует вопросы о своей колонке PG или книги. Напишите письмо на адрес [email protected] или посетите сайт guitarservices.com, чтобы узнать больше. информация о его мастерских по ремонту гитар.

Температурно-зависимая FRET-спектроскопия для высокопроизводительного анализа самоорганизующихся наноструктур ДНК в реальном времени

Seeman, N.C. Соединения и решетки нуклеиновых кислот. J. Theor. Биол. 99 , 237–247 (1982).

CAS Статья Google Scholar

Feldkamp, U. & Niemeyer, C.M. Рациональный дизайн наноархитектур ДНК. Angew. Chem. Int. Эд. Англ. 45 , 1856–1876 (2006).

CAS Статья Google Scholar

Lin, C., Liu, Y., Ринкер, С. и Ян, Х. Самосборка на основе ДНК-плитки: построение сложных наноархитектур. Chemphyschem. 7 , 1641–1647 (2006).

CAS Статья Google Scholar

Симан, Северная Каролина ДНК в материальном мире. Nature 421 , 427–431 (2003).

Артикул Google Scholar

Seeman, N.C. Обзор структурной нанотехнологии ДНК. Мол. Biotechnol. 37 , 246–257 (2007).

CAS Статья Google Scholar

Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L.A., Seeman, N.C. Конструирование и самосборка двумерных кристаллов ДНК. Nature 394 , 539–544 (1998).

CAS Статья Google Scholar

Ян, Х., Парк, С.Х., Финкельштейн, Г., Рейф, Дж. И Лабин, Т. Самосборка белковых массивов и высокопроводящих нанопроволок по шаблону ДНК. Наука 301 , 1882–1884 (2003).

CAS Статья Google Scholar

He, Y. et al. Симметрия последовательностей как инструмент для конструирования наноструктур ДНК. Angew. Chem. Int. Эд. Англ. 44 , 6694–6696 (2005).

CAS Статья Google Scholar

Лю Ю., Ке, Й. и Ян, Х. Самосборка симметричных наномассивов ДНК конечного размера. J. Am. Chem. Soc. 127 , 17140–17141 (2005).

CAS Статья Google Scholar

Лунд, К., Лю, Ю., Линдси, С., Ян, Х. Самостоятельная сборка молекулярной перфорированной доски. J. Am. Chem. Soc. 127 , 17606–17607 (2005).

CAS Статья Google Scholar

Ротемунд, П.W. Складывание ДНК для создания наноразмерных форм и узоров. Nature 440 , 297–302 (2006).

CAS Статья Google Scholar

Malo, J. et al. Разработка двумерного кристалла белок-ДНК. Angew. Chem. Int. Эд. Англ. 44 , 3057–3061 (2005).

CAS Статья Google Scholar

Ши В.М., Киспе Дж.Д. и Джойс, Г.Ф. Одноцепочечная ДНК длиной 1,7 тыс. Оснований, которая складывается в наноразмерный октаэдр. Nature 427 , 618–621 (2004).

CAS Статья Google Scholar

Sacca, B., Meyer, R., Feldkamp, U., Schroeder, H. & Niemeyer, C.M. Высокопроизводительный мониторинг самосборки наноструктур ДНК в режиме реального времени с помощью FRET-спектроскопии. Angew. Chem. Int. Эд. Англ. 47 , 2135–2137 (2008).

CAS Статья Google Scholar

Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann. Phys. 2 , 55–75 (1948).

Артикул Google Scholar

Cantor, C.R., Warshaw, M.M. & Шапиро, H. Олигонуклеотидные взаимодействия. 3. Изучение кругового дихроизма конформации дезоксиолигонуклеотидов. Биополимеры 9 , 1059–1077 (1970).

CAS Статья Google Scholar

Clegg, R.M. Флуоресцентный резонансный перенос энергии и нуклеиновые кислоты. Methods Enzymol. 211 , 353–388 (1992).

CAS Статья Google Scholar

Fairclough, R.H. & Cantor, C.R. Использование синглет-синглетного переноса энергии для изучения макромолекулярных сборок. Methods Enzymol. 48 , 347–379 (1978).

CAS Статья Google Scholar

Lilley, D.M. И Уилсон, Т. Флуоресцентный резонансный перенос энергии как структурный инструмент нуклеиновых кислот. Curr. Opin. Chem. Биол. 4 , 507–517 (2000).

CAS Статья Google Scholar

Страйер, Л. и Хогланд, Р.П. Передача энергии: спектроскопическая линейка. Proc. Natl. Акад. Sci. США 58 , 719–726 (1967).

CAS Статья Google Scholar

Clegg, R.M., Murchie, A.I. И Лилли, Д. Структура раствора четырехстороннего соединения ДНК в условиях низкого содержания соли: анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии. Biophys. J. 66 , 99–109 (1994).

CAS Статья Google Scholar

Клегг, Р.M. et al. Анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии структуры четырехстороннего соединения ДНК. Биохимия 31 , 4846–4856 (1992).

CAS Статья Google Scholar

Clegg, R.M., Murchie, A.I., Zechel, A. & Lilley, D.M. Наблюдение спиральной геометрии двухцепочечной ДНК в растворе с помощью флуоресцентного резонансного переноса энергии. Proc. Natl. Акад. Sci. США 90 , 2994–2998 (1993).

CAS Статья Google Scholar

Ozaki, H. & McLaughlin, L.W. Оценка расстояний между конкретными меченными каркасами сайтами в ДНК с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии. Nucleic Acids Res. 20 , 5205–5214 (1992).

CAS Статья Google Scholar

Eis, P.S. И Миллар, Д. Конформационные распределения четырехстороннего соединения ДНК, выявленные с помощью резонансного переноса энергии флуоресценции с временным разрешением. Биохимия 32 , 13852–13860 (1993).

CAS Статья Google Scholar

Ярес-Эриджман, Э.А. И Джовин, Т. Определение спиральной направленности ДНК путем резонансного переноса энергии флуоресценции. J. Mol. Биол. 257 , 597–617 (1996).

CAS Статья Google Scholar

Mergny, J.L. Перенос энергии флуоресценции как зонд для образования тетраплекса: i-мотив. Биохимия 38 , 1573–1581 (1999).

CAS Статья Google Scholar

Muller, B.K., Reuter, A., Simmel, F.C. И Лэмб, Д.С. Однопарная FRET-характеристика ДНК-пинцета. Nano Lett. 6 , 2814–2820 (2006).

Артикул Google Scholar

Berney, C. & Danuser, G. FRET или без FRET: количественное сравнение. Biophys. J. 84 , 3992–4010 (2003).

CAS Статья Google Scholar

Sapsford, K.E., Berti, L. & Medintz, I.L. Материалы для анализа флуоресцентного резонансного переноса энергии: за пределами традиционных донорно-акцепторных комбинаций. Angew. Chem. Int. Эд. Англ. 45 , 4562–4589 (2006).

CAS Статья Google Scholar

Де Чиан, А.и другие. Анализы плавления на основе флуоресценции для изучения лигандов квадруплексов. Методы 42 , 183–195 (2007).

CAS Статья Google Scholar

Вамози, Г. и Клегг, Р.М. Переход спираль-клубок дуплексов ДНК и шпилек наблюдается по множеству параметров флуоресценции. Биохимия 37 , 14300–14316 (1998).

CAS Статья Google Scholar

Mergny, J.Л. и Лакруа, Л. Анализ термических кривых плавления. Олигонуклеотиды 13 , 515–537 (2003).

CAS Статья Google Scholar

Шульман, Р. и Винфри, Э. Синтез кристаллов с программируемым кинетическим барьером для нуклеации. Proc. Natl Acad. Sci. 104 , 15236–15241 (2007).

CAS Статья Google Scholar

Гринфилд, Н.J. Использование кругового дихроизма, полученного как функция температуры, для определения термодинамики взаимодействия белков при разворачивании и связывании. Nat. Protoc. 1 , 2527–2535 (2006).

CAS Статья Google Scholar

Cooper, A. & Johnson, C.M. Дифференциальная сканирующая калориметрия. Methods Mol. Биол. 22 , 125–136 (1994).

CAS PubMed Google Scholar

Привалов П.Л., Потехин С.А. Сканирующая микрокалориметрия в изучении температурных изменений белков. Methods Enzymol. 131 , 4–51 (1986).

CAS Статья Google Scholar

SantaLucia, J. Jr., Allawi, H.T. И Сеневиратне П.А. Улучшенные параметры ближайшего соседа для прогнозирования стабильности дуплекса ДНК. Биохимия 35 , 3555–3562 (1996).

CAS Статья Google Scholar

Кавалуцци, М.J. & Borer, P.N. Пересмотренные коэффициенты УФ-экстинкции для нуклеозид-5′-монофосфатов и неспаренных ДНК и РНК. Nucleic Acids Res. 32 , e13 (2004).

Артикул Google Scholar

Уоррен, У. Дж. И Велла, Г. Принципы и методы анализа и очистки синтетических дезоксирибонуклеотидов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Мол. Biotechnol. 4 , 179–199 (1995).

CAS Статья Google Scholar

Мур, Д. и Доухан, Д. Очистка и концентрирование ДНК из водных растворов. Curr. Protoc. Мол. Биол. Глава 2, Блок 2 1A (2002).

Мур, Д., Даухан, Д., Чори, Дж. И Рибаудо, Р.К. Выделение и очистка больших рестрикционных фрагментов ДНК из агарозных гелей. Curr. Protoc. Мол. Биол. Глава 2, Раздел 2.6 (2002).

Bowen, E.J. & Саху, Дж. Влияние температуры на флуоресценцию растворов. J. Phys. Chem. 63 , 4–7 (1959).

CAS Статья Google Scholar

Marras, S.A., Kramer, F.R. И Тяги, С. Эффективность резонансного переноса энергии флуоресценции и контакт-опосредованного тушения в олигонуклеотидных зондах. Nucleic Acids Res. 30 , e122 (2002).

Артикул Google Scholar

Устранение неполадок, связанных с гудением ладовой струны акустической гитары

Времена года могут быть тяжелыми для вашей гитары. Изменения влажности и температуры обычно могут вызывать раздражение. Ладовое жужжание — это жужжащий звук, который возникает, когда струна вибрирует относительно одного или нескольких ладов. Иногда вы можете слышать жужжание ладов в открытой позиции, а иногда это могут быть определенные струны и / или лады.

Обычно легко определить, какие струны и лады гудят. Вообще говоря, если кажется, что гудение происходит только на 1-м ладу, это обычно означает, что гайка слишком низкая или канавки в гайке изношены слишком низко. Если гудение сосредоточено в средних ладах, с 3-го по 9-й, анкерный стержень может потребовать регулировки. Если гудение исходит от удлинителя грифа, скорее всего, это связано с влажностью.

Мы подготовили несколько советов вместе с нашим отделом гарантии / ремонта, чтобы помочь вам в устранении неполадок.

1) Высота струны : Первый шаг к устранению неполадок лада гудения — это измерение высоты струны в месте соединения грифа с корпусом. Чтобы струны могли вибрировать, не вызывая гудения ладов, мы установили гитары на 3/32 дюйма на басовой стороне и на 2/32 дюйма на высоких частотах. Это измерение производится на 14-м ладу для большинства гитар и на 12-м ладу для салонных боди-гитар. Измерьте расстояние от верха лада до низа струны.

Если высота вашей строки ниже этих настроек, вам нужно вернуть действие к заводским спецификациям.Для этого нужно отрегулировать анкерный стержень и соответственно поднять седло.

Узнайте, как отрегулировать анкерный стержень здесь. Мы рекомендуем правильное облегчение .005–007 »: https://youtu.be/xyqrSRI2asc?list=UUM-CsUeK57J8grv9BSBRRhQ

После регулировки анкерного стержня еще раз проверьте измерения высоты струны. Если вы по-прежнему ниже заводских настроек 3/32 дюйма на басовой стороне и 2/32 дюйма на высоких частотах, вам следует начать с высокого седла и отшлифовать его до заводских спецификаций для высоты струны 3/32 дюйма. со стороны низких частот и 2/32 дюйма на стороне высоких частот.

2) Получите установку : рекомендуется, чтобы кто-нибудь с опытом произвел установку за вас. Тот, кто занимается настройкой, должен обладать общими знаниями по ремонту гитары. Важные моменты, которые следует учитывать:

· Поворачивайте анкерный стержень только на ¼ оборота, чтобы гитара акклиматизировалась.

· Шлифование седла, не заходя слишком далеко.

· При необходимости отрегулировать гайку.

3) Влажность : Влажность может играть важную роль как в возникновении шума, так и в его предотвращении.В идеале гитару следует постоянно хранить при влажности от 40% до 50%.

Когда в ручном инструменте влажность ниже рекомендуемого уровня, древесина высыхает и заставляет верхнюю часть опускаться или погружаться. Когда верх опускается, мост и струны опускаются вместе с ним и опускают струны туда, где они могут вызвать раздражение жужжание.

При переувлажнении верхушка поднимется и будет казаться раздутой. Удлинитель грифа (лады 14-20) приклеивается к верху, и когда верх поднимается, надставка грифа поднимается вместе с ним.Это приводит к тому, что гриф выглядит как «прыжок с трамплина», а лады на удлинении грифа находятся ближе к струнам, чем остальная часть грифа. Это может вызвать жужжание ладов в верхнем регистре.

Несколько советов, которые следует учитывать:

Чтобы убедиться, что ваша акустическая гитара должным образом увлажнена, аккуратно положите длинный прямой край на верхнюю часть гитары. Изначально ваша гитара была сделана с слегка изогнутой верхней частью. При правильном увлажнении прямая кромка должна соприкасаться с верхом, за исключением небольшого зазора на внешнем крае верха (размером прибл.1/32 дюйма с обоих концов). Если вы видите зазор на внешнем крае верха более 1/32 дюйма, ваша гитара вздута и чрезмерно увлажнена. Некоторые пакеты с влагопоглотителем, хранящиеся в корпусе гитары или вместе с гитарой в футляре, могут помочь высушить ее. Вы также должны снизить общий уровень влажности с помощью осушителя воздуха в помещении. Продолжайте осушение, пока зазор, который вы измерили ранее, не уменьшится до 1/32 дюйма на внешних концах.

Если вы положите линейку поверх верха, и линейка не соприкасается с верхом, это означает, что верхняя часть упала и высохла.В этом случае вам нужно будет поднять общий уровень влажности до тех пор, пока вы не положите линейку сверху и не достигнете желаемого размера зазора 1/32 дюйма на любом конце линейки.

крутых запчастей для внедорожников на пасхальном сафари на джипах в Моаве 2016 # EJS2016

Пасхальное сафари на джипах в Моаве объединяет любителей бездорожья и производителей запасных частей со всей страны, а в некоторых случаях и со всего мира. Конечно, Моав предлагает одни из самых живописных и сложных маршрутов, которые только можно себе представить, но одно из событий, которое мы всегда с нетерпением ждем в течение недели пасхальных джипов, — это выставка продавцов, проводимая на арене Spanish Trail.В отличие от отраслевых выставок, эта выставка поставщиков дает вам, потребителю, возможность поближе познакомиться с новейшими внедорожными продуктами на вторичном рынке и получить доступ к производителям, которые их создают. Выставка продавцов проводится только в четверг и пятницу перед Пасхой. Вы найдете все, от новейших технологий для внедорожных шин до новейших элементов подвески, электрооборудования и осей. Большую часть дня мы прошли через шоу, выбирая самые крутые новые продукты 4×4.Для получения дополнительной информации о ежегодном пасхальном сафари на джипах в Моаве и выставке продавцов посетите веб-сайт Red Rock 4-Wheelers по адресу rr4w.com.

Просмотреть все 17 фото

Torq Motorsports (torqaxle.com) представила третий участник Ultra-14 с высокой шестерней. Ultra-14 считается самым мощным дифференциалом третьего члена с высокой шестерней на рынке. Корпус дифференциала изготовлен на станке с ЧПУ из алюминиевой заготовки и оснащен зубчатой передачей с обратным нарезанием из сплава с высоким содержанием никеля и молибдена толщиной 10 1/2 дюйма. Каждый третий элемент приводится в движение 37-шлицевой вилкой серии 1480, установленной на валу-шестерне диаметром 2 дюйма, который размещен в опоре шестерни заготовки с 4-дюймовыми подшипниками.Золотник с 40 шлицами или дополнительный 40-шлицевой блокиратор ARB Air Locker поддерживается крышками несущих подшипников с четырьмя болтами толщиной 2 дюйма, которые удерживают несущие подшипники диаметром 4 дюйма. В настоящее время доступно соотношение 5,38: 1, а в ближайшее время — 5,13: 1. Ultra-14 на 100% производится в США и продается в полностью собранном виде с 12-точечными легкосплавными крепежными деталями и болтом несущей нагрузки.

Просмотреть все 17 фото

Dakota Customs (dakota-customs.com) теперь предлагает переделку пикапа для четырехдверной модели Jeep JK Unlimited.В комплект входят все панели кузова, необходимые для трансформации грузовика. Не волнуйтесь, если у вас нет навыков для самостоятельного выполнения работы — компания сделает это за вас. Другие продукты Dakota Customs включают комплекты для самостоятельной замены двигателей Hemi V-8 для Wrangler и готовые джипы под ключ.

Просмотреть все 17 фото

У вас есть старая лебедка Warn 8274, которую вы хотите ускорить и быстрее остановить? Red Winches (red-winches.com) может иметь именно то, что вам нужно. Двухмоторный верхний комплект Storm 8274 доступен с пневматическими тормозами или без них.В стандартный комплект входит зубчатая передача, обеспечивающая на 25% более высокую скорость троса без нагрузки, чем у стандартной лебедки 8274. Дополнительная версия с повышающей передачей позволяет увеличить скорость линии без нагрузки на 40%. Torq Motorsports (torqaxle.com) предлагает эти комплекты здесь, в США.

Просмотреть все 17 фото

Компания DeWalt (dewalt.com) представила этот компактный и легкий портативный аккумуляторный сварочный аппарат. DCW100K может выполнять сварку при токе до 140 ампер или сварку TIG до 150 ампер. Он весит стройные 24 1/2 фунта, так что вы можете брать его практически куда угодно.Нам сказали, что батареи хватит на время, достаточное для того, чтобы прожигать 17 стержней 3/32 дюйма, что должно быть более чем достаточно для ремонта большинства трейлов. Он также может сваривать питание 120 В переменного тока в гибридном режиме. Каждый сварочный аппарат поставляется в комплекте с электрододержателем с проводом длиной 13 футов, кабелем заземления с проводом длиной 10 футов и зажимом, зарядным устройством на 120 В и шнуром для зарядки.

Просмотреть все 17 фотографий

Если вы хотите остановить ржавчину, вы можете подумать о полностью алюминиевом сменном кузове Aqualu (aqualu.com) для вашего Jeep Wrangler JK, выпущенного в 2007 году.Ванна доступна как для двух-, так и для четырехдверной модели. Доступны три различных алюминиевых задних двери JK, включая откидывающуюся модель, заднюю дверь для хранения и двери для машин скорой помощи. Как и все алюминиевые корпуса Aqualu, ванны JK изготовлены из 0,156-дюймового морского алюминиевого сплава 5052. Алюминиевые передние и задние крылья также были на выставке и должны быть доступны к тому моменту, когда вы это прочтете.

Просмотреть все 17 фото

Maxxis (maxxis.com) представила новую шину RAZR MT. Радиальный RAZR доступен в 34 различных размерах до 40 дюймов в диаметре.У большинства размеров боковины двухслойные. Однако 40-дюймовая версия и некоторые другие имеют более прочные трехслойные боковины. Говорят, что RAZR был разработан с нуля для обеспечения максимальной производительности как на дороге, так и на бездорожье. Он имеет совершенно новый дизайн протектора, который помогает минимизировать шум, блоки брони боковины для защиты от проколов и новый состав с химическими наполнителями, которые, как говорят, помогают протектору противостоять сколам и разрывам, позволяя шинам служить дольше.

Просмотреть все 17 фото

Skyjacker (skyjacker.com) объединился с легендой бездорожья и членом Зала славы внедорожного автоспорта Куртом Ледюком. Команда разработала комплекты койловеров серии LeDuc для нынешнего двух- и четырехдверного Jeep Wrangler JK 2007 года. Амортизаторы были протестированы и настроены Куртом ЛеДуком с использованием клапанов для конкретного применения, которые, как утверждается, обеспечивают наилучшие характеристики как на дороге, так и на бездорожье. Койловеры можно приобрести как комплект, или вы можете просто обновить койловеры для вашей текущей системы подвески Skyjacker.

Просмотреть все 17 фото

Если вам нравятся джипы, кемпинг и кулинария, возможно, вам стоит обратить внимание на продукцию Jeep Kitchen (jeepkitchen.com). Jeep Kitchen выпускается из гальванизированной или нержавеющей стали и подходит для Jeep Wrangler Unlimited ’08–’15, XJ Cherokee и двухдверных моделей JK со снятым задним сиденьем. Выдвижные ящики позволяют хранить всю посуду и продукты и, как говорят, не дребезжат во время вождения благодаря высококачественному оборудованию. Выдвижная конструкция из трех частей предлагает более глубокое основное пространство для кастрюль и посуды, плоскую поверхность для резки и подготовки и платформу для плиты, которая раскатывается как столешница.

Просмотреть все 17 фотографий

EVO Manufacturing (evomfg.com) представила по требованию преобразование пневматической подвески Jeep Wrangler Rubicon с электронным отключаемым стабилизатором поперечной устойчивости. Новая система дает вам возможность отсоединять и повторно подсоединять стабилизатор поперечной устойчивости на любой скорости в любом положении переключателя раздаточной коробки. Новые алюминиевые болты торцевой крышки из заготовки вместо проблемного заводского электронного привода на стабилизаторе поперечной устойчивости OE Rubicon.

Посмотреть все 17 фото

Компания Oztent (oztent.com) представила несколько различных решений для кемпинга, включая Jet Tent Bunker.Бункер для палаток Jet — отличный вариант для тех, кто ненавидит громоздкий процесс складывания наземных палаток, но хочет большей защиты от элементов, чем обеспечивает открытая детская кроватка. Каждый бункер для палатки Jet построен на стальном каркасе с конструкцией носилок с перекрещенными ногами, которая, как говорят, выдерживает более 330 фунтов. Стенки бункера изготовлены из водостойкого хлопка с покрытием из водонепроницаемого хлопкового полотна рипстоп. Кровать из полиэстера с покрытием из ПВХ поставляется с мягкой набивкой. Бункер Jet Tent Bunker также имеет большие сетчатые оконные панели для вентиляции и поставляется в комплекте с собственной сверхмощной сумкой для переноски.

Просмотреть все 17 фото

Dometic (Dometic.com) предлагает полную линейку кемпингового оборудования для автомобилей и транспортных средств для отдыха, включая этот массивный портативный холодильник. Есть много термоэлектрических и компрессорных портативных холодильников и морозильников на выбор. Холодильники доступны для нескольких источников питания. Более крупные холодильники / морозильники CFX обеспечивают удобство работы с двумя зонами, поэтому у вас есть и холодильник, и морозильная камера, как дома, но гораздо более компактные и портативные. В некоторых холодильниках Dometic даже есть USB-порты для зарядки ваших электронных устройств.

Просмотреть все 17 фото

Spidertrax (spidertrax.com) уже предлагает полный модельный ряд проставок для колес 4×4 и колесных адаптеров. Новейшая модель предназначена для Toyota Tundra 2007 года выпуска. Как и все проставки для колес Spidertrax, детали Tundra изготавливаются прямо здесь, в США, из американского алюминия 6061 T6. Даже колесные шпильки производятся в США по спецификациям Spidertrax. Прокладки Tundra имеют толщину 1 1/4 дюйма и дважды анодированы темно-синим цветом, что, как говорят, обеспечивает вдвое большую коррозионную стойкость. Каждая колесная проставка ориентирована как на колесо, так и на ступицу.

Просмотреть все 17 фото

Ищете немного больше энергии под капотом своего Jeep? Boosted Technologies (boostedtech.com) может предложить то, что вы ищете. Компания предлагает оригинальные нагнетатели Eaton Gen IV M90, модифицированные для различных применений Jeep, включая JK Wrangler 3.6L Pentastar V-6, WJ Grand Cherokee 4.7L V-8 и модель Cherokee XJ 4.0L, которая умещается под стандартным капотом. . Все комплекты включают компоненты и оборудование, необходимые для полного преобразования Plug and Play.

Просмотреть все 17 фотографий

Fabtech (fabtechmotorsports.com) теперь предлагает более 60 новых систем подвески для Jeep JK Wrangler ’07–’16. Комплекты для переоборудования койловеров включают амортизаторы Dirt Logic 2 1/2 дюйма из нержавеющей стали. Также новинкой является 5-тонный шарнир Fabtech, который можно найти на многих новых рычагах управления подъемным комплектом. На каждый из этих массивных шарниров дается пожизненная гарантия от износа.

Просмотреть все 17 фотографий

Компания TeraFlex (teraflex.com) представила багажник JK Nebo из экструдированного алюминия с жестким анодированием.Стойка крепится через жесткую крышу Wrangler Unlimited и прикрепляется к заводской спортивной балке, обеспечивая полную поддержку груза. Низкопрофильный и обтекаемый дизайн снижает сопротивление воздуха и шум ветра. Считается, что каждый багажник JK Nebo совместим с наиболее популярными и доступными аксессуарами для багажников на крыше. На все крепежные детали нанесено покрытие в соответствии со спецификациями производителей оборудования для защиты от коррозии.

Просмотреть все 17 фото

Новым дополнением к линейке амортизаторов Fox (ridefox.com) является амортизатор IFP серии 2.0 Adventure.Амортизаторы IFP серии Adventure доступны как для подъема, так и для установки на болтах с базовой высотой. Каждый амортизатор серии Adventure оснащен бесшовным корпусом из сплава, 5/8-дюймовым хромированным стержнем из термообработанной легированной стали, внутренним однотрубным резервуаром IFP, втулками из нитриловой резины и толстым серебряным порошковым покрытием. Доступны дополнительные экраны Roost Shield для защиты валов амортизаторов и уплотнений от ударов камней.

Посмотреть все 17 фото

Offroad Design (offroaddesign.com) теперь предлагает систему задней тяги и койловера для грузовиков GM ’67-87, а также Blazers и Suburbans до ’91.Утверждается, что приварной комплект обеспечивает вертикальный ход колеса 16 дюймов, точное рулевое управление и контроль наклона оси. В каждый комплект входят массивные наконечники штанги FK размером 1 1/4 дюйма на нижних рычагах и амортизаторы King 2 1/2 дюйма с бачками. Жесткость пружины и высота дорожного просвета легко регулируются в соответствии с вашими потребностями. В комплект входят стальные звенья DOM, но также доступны дополнительные твердые алюминиевые звенья 7075 с выгравированным логотипом Offroad Design.

Что такое Fret Sprout?

Это обычная проблема, и вы должны ее исправить.

Отросток ладов: нежелательное состояние, при котором концы ладов выступают за края накладки грифа.

Проведите большим пальцем и пальцами по бокам грифа гитары или баса; по верхним краям шеи. Стороны грифа должны быть гладкими и ровными. Хотя вы, вероятно, почувствуете концы ладов, вы не должны чувствовать, что они выступают из любого края грифа. Если да, поздравляю — у вас появился росток раздражения.Это случается со всеми видами ладовых инструментов, независимо от их стоимости.

Легкий рост лада может быть заметным, но не особенно раздражающим, и он не обязательно помешает вам играть на инструменте. Это зависит от вас, хотя есть много игроков, у которых даже легкий росток ладов сводит их с ума. Ярко выраженный рост ладов — это совсем другая история — довольно неудобная и проблема технического обслуживания, требующая внимания и ремонта, прежде чем инструмент действительно будет признан пригодным для использования.

Если у вашей гитары или бас-гитары есть ростки ладов, вероятно, они не были оставлены с завода в таком виде. Скорее всего, проблема возникла позже — возможно, во время транспортировки, хранения или розничной демонстрации — когда обычная причина, низкая влажность, вызвала сжатие грифа.

Лады сделаны из неподатливого металла — ладовой проволоки, поэтому не похоже, чтобы они как-то стали длиннее. Грифы, с другой стороны, сделаны из дерева, а дерево — это некогда живой материал, который определенно поддается капризам климата и другим условиям окружающей среды.

При обезвоживании гриф может фактически сужаться, в результате чего концы ладов слегка выступают с обеих сторон. Это особенно распространено в жарком и сухом климате и в регионах с суровыми зимами, где люди довольно жестко управляют своими системами отопления. Это снижает влажность окружающей среды, из-за чего древесина дает усадку, что приводит к образованию ростков лада. Для инструмента, который вам действительно небезразличен, ростки ладов — одна из причин, по которым вы должны держать его в определенном диапазоне температуры и влажности (общее правило состоит в том, что вашей гитаре комфортно в том же климатическом диапазоне, что и вам. в).

К счастью, сама природа ростков ладов позволяет легко обнаружить их даже новичкам (используйте тест, описанный выше), и обычно их легко исправить. Однако вам понадобится кто-то квалифицированный для выполнения этой работы, если только у вас в ящике с инструментами нет специального напильника для снятия фаски, а вы уже делали подобное раньше. Если предположить (один), что вы этого не сделаете, и (два), что нет, напильник для снятия фаски — это специальный инструмент в форме блока, который мастера, техники и другой обслуживающий персонал используют для равномерного выравнивания концов ладов заподлицо с краями накладка грифа (обычно скошенная под углом 35º или около него).Затем они «обрабатывают» концы ладов, используя другие специализированные файлы, и полируют их для плавного выравнивания и однородности, а также чистого профессионального вида. Весь процесс похож на маникюр для ладов, и все стоит того.

48-точечная установка одномолекулярного FRET с периодическим возбуждением акцептора

Abstract

Одномолекулярный FRET (smFRET) позволяет измерять расстояния между донорными (D) и акцепторными (A) флуорофорами в диапазоне 3–10 нм. На основе раствора smFRET позволяет измерять события связывания-разрыва или конформационные изменения меченых красителем биомолекул без усреднения по ансамблю и без поверхностных возмущений.При использовании двойного (или мульти) лазерного возбуждения smFRET позволяет определять количество флуоресцентных меток на каждой молекуле, значительно расширяя возможности исследования гетерогенных образцов. Основным недостатком smFRET на основе решений является низкая пропускная способность, что делает повторные измерения дорогостоящими и препятствует изучению кинетических явлений в режиме реального времени.

Здесь мы демонстрируем высокопроизводительную систему smFRET, которая мультиплексирует сбор данных с использованием 48 точек возбуждения и двух 48-пиксельных матричных детекторов SPAD.В системе используются два возбуждающих лазера, позволяющих разделять виды с помощью одного или двух активных флуорофоров. Эффективность системы продемонстрирована на наборе двухцепочечных олигонуклеотидов с двойной меткой и разным расстоянием между красителями D и A вдоль дуплекса ДНК. Мы показываем, что время сбора данных для точной идентификации субпопуляций сокращается с нескольких минут до секунд, открывая путь к высокопроизводительным приложениям скрининга и исследованиям кинетики ферментативных реакций, таких как транскрипция ДНК бактериальной РНК-полимеразой в реальном времени.

I. ВВЕДЕНИЕ

Детальное знание трехмерной (3D) атомистической структуры макромолекулярных комплексов необходимо для понимания их биологической функции. На протяжении десятилетий рентгеновская кристаллография и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) были предпочтительными методами для получения макромолекулярных структур с атомным разрешением. В последнее время криоэлектронная микроскопия одиночных частиц (крио-ЭМ) дополнила эти методы определения крупных макромолекулярных структур с добавленной способностью классифицировать различные конформации.Однако макромолекулы спонтанно и динамически исследуют различные конформации в равновесии, которые трудно уловить с помощью вышеупомянутых методов. Для понимания функциональных ролей этих структур требуется полная динамическая картина. Одномолекулярный резонансный перенос энергии Ферстера (smFRET) проложил путь для изучения такой структурной динамики в биологически значимых условиях. smFRET позволяет определять каждое конформационное состояние, которое может существовать в ансамбле макромолекулярных комплексов, а также расстояние между конкретными остатками для каждого состояния ^1–4.Недавно несколько групп использовали smFRET для измерения расстояний между множественными разными парами остатков для построения трехмерных макромолекулярных структур различных конформаций путем триангуляции и сравнения с существующими рентгеновскими кристаллическими структурами ^5-10. Более того, smFRET может измерять временную эволюцию различных расстояний между множественными парами FRET и, следовательно, сообщать о динамической трехмерной структуре макромолекулы, претерпевающей конформационные изменения. До сих пор из-за требования низкой концентрации образца, вызванного необходимостью иметь не более одной молекулы в ограниченном дифракцией конфокальном объеме в данный момент времени ^1,11, можно измерить только очень медленную кинетику.Следовательно, повышенная пропускная способность важна как для статических, так и для динамических измерений на нескольких расстояниях.

Чтобы преодолеть это ограничение, мы недавно ввели схему многоточечного возбуждения, использующую преимущества новых решеток однофотонных лавинных диодов (SPAD) ^12–14. Мы продемонстрировали, что полученная установка действительно позволяла получать данные об отдельных молекулах, сравнимые со стандартными установками с одним пятном, но с пропускной способностью, которая масштабировалась с количеством пятен возбуждения.Мы проиллюстрировали применение этой повышенной пропускной способности, измеряя кинетику закрытия пузырьков во время ускользания промотора в бактериальной транскрипции ¹⁴. Эти обнадеживающие результаты были частично неудовлетворительными, поскольку они были получены только с 8 пятнами, а также потому, что установка включала только один лазер, используемый для возбуждения донорного (D) красителя пары донор-акцептор (DA) FRET ¹⁴. Однолазерный smFRET не может отличить молекулы с низким FRET (молекулы с двумя активными красителями D и A, в которых расстояние D-A велико по сравнению с характерным масштабом длины FRET) от молекул, содержащих только D (т.е.е. молекулы с одним D-красителем или молекулы с двойной меткой с инактивированным или обесцвеченным A-красителем). Поскольку последние категории присутствуют в большинстве образцов, важно идентифицировать и отделить их от представляющих интерес молекул с низким FRET.

Чтобы решить эту проблему, несколько лет назад было введено микросекундное переменное лазерное возбуждение smFRET (далее для краткости называемое μsALEX) ¹⁵, а затем распространено на схемы импульсного лазерного возбуждения (nsALEX ¹⁶ или PIE ¹⁷). ).Вкратце, в μsALEX два возбуждающих лазера поочередно включаются и выключаются каждые несколько десятков мкс, что позволяет отделить виды только с одним активным красителем (популяции только D, только A) от видов с двойной меткой с активными обоими красителями ( FRET населения). Фактически, только популяции FRET дают сигнал флуоресценции как во время возбуждения D-лазера из-за возбуждения D-красителя, так и во время возбуждения A-лазера из-за возбуждения A-красителя. Это, в свою очередь, увеличивает количество субпопуляций FRET, которые могут быть идентифицированы в выборке в режиме низкой средней эффективности FRET.С тех пор эта схема была расширена до 3 или 4 лазерных возбуждений, что позволило использовать мощные приложения для сортировки молекул ^18,19. Упрощенная версия этого принципа чередования лазеров была представлена в работе. 20, где лазер с D-возбуждением остается включенным все время, в то время как A-лазер чередуется. Этот метод периодического акцепторного возбуждения одиночной молекулы FRET ²⁰ (для краткости обозначается как PAX) позволяет упростить оптическую установку, сохраняя при этом преимущества μsALEX, а именно возможность определять стехиометрию красителей D и A на каждой отдельной молекуле или определить изменения квантовых выходов флуоресценции ²¹.Здесь мы представляем значительное улучшение нашей исходной многоточечной установки путем (i) введения 48-точечной схемы освещения и обнаружения и (ii) реализации подхода освещения PAX с двумя лазерами.

Эта статья организована следующим образом. В разделе II мы кратко представляем оптическую установку, детекторы (раздел IIA) и схему модуляции (раздел IIB). В разделе III мы сообщаем об измерениях отдельных молекул, начиная с краткого описания анализа данных (раздел IIIA). Чтобы продемонстрировать однородность по каналам, для каждого пятна мы сообщаем пиковую скорость фотонов во всплесках (раздел IIIB) и гистограммы E-S (раздел IIIC).Наконец, в разделе IIID мы представляем сравнение измерений μsALEX в одной точке и PAX в 48 точек за 15-секундный сбор данных.

A. Программное обеспечение и доступность данных

Программное обеспечение, необходимое для работы с многоточечной установкой (включая создание шаблона LCOS-SLM, код временных меток LabVIEWFPGA, управление пьезомотором и т. Д.), Организовано в различных репозиториях и доступно на GitHub по адресу https: / /github.com/multispot-software. Программное обеспечение, используемое для анализа данных в этой статье, можно найти в репозитории 48-spot-smFRET-PAX-analysis.Ссылки на конкретные записные книжки добавляются в заголовок каждого рисунка. Файлы данных общедоступны на Figshare ²².

II. ОПИСАНИЕ НАСТРОЙКИ

В этом разделе мы кратко опишем установку. Более подробное описание можно найти в Приложении A, а детали выравнивания лазера и массива SPAD можно найти в Приложении B и C соответственно.

Схема установки представлена на рис. 1. Установка включает два лазера непрерывного возбуждения мощностью 1 Вт (зеленый: 532 нм, красный: 628 нм), причем только красный лазер модулируется через акустооптический модулятор (АОМ).После регулировки поляризации и расширения луча два лазера модулируются по фазе с помощью соответствующего LCOS-SLM, генерируя два шаблона из 48 точек на плоскости после каждого LCOS-SLM (, плоскость изображения LCOS). Затем два лазера объединяются дихроичным зеркалом ( DM _MIX ) и повторно коллимируются ( L ₃) перед фокусировкой в образец линзой объектива с высокой числовой апертурой (NA) (60x, NA = 1,2). ). Излучаемая флуоресценция собирается той же линзой объектива, разделена по длине волны возбуждения через двухполосное полихроическое зеркало ( DM _EX ) и фокусируется линзой трубки ( L ₂) в плоскости изображения.Затем излучаемый флуоресцентный свет повторно коллимируется ( L ₄), разделяется на донорные и акцепторные спектральные полосы ( DM _EM ) и фокусируется на двух различных 48-пиксельных массивах SPAD, установленных на моторизованном микропозиционировании. этапы. Система выровнена так, что каждый пиксель SPAD оптически сопряжен с одним пятном возбуждения в образце.

Рисунок 1.

Схема установки smFRET-PAX на 48 точек. См. Подробное описание в тексте руководства и в приложении A.

Выходные данные детекторов обрабатываются платой на базе FPGA, которая выполняет временные метки фотонов с разрешением 12,5 нс и передает данные на главный компьютер. На главном ПК запускается программное обеспечение для сбора данных, которое отображает 96-канальные графики в реальном времени, выполняет процедуры выравнивания и сохраняет данные на диске. Дальнейшее преобразование и анализ данных выполняется на втором ПК.

A. Детекторы

Текущая 48-точечная установка использует два идентичных массива SPAD 12×4 пикселей, архитектура и производительность которых представлены на рисунке 23.Здесь мы описываем только самые важные особенности. Активная область каждого пикселя имеет диаметр 50 мкм. Массив состоит из 4 строк по 12 пикселей (4×12) с шагом 500 мкм в каждом направлении.

Чтобы легко интегрировать детекторы в многоточечную установку, мы разработали модуль подсчета фотонов, который объединяет 48-пиксельную матрицу SPAD и электронику, необходимую для работы устройства, сбора и передачи данных, в компактный и удобный модуль. В частности, массив SPAD размещен в герметичной камере, отделенной от остальной части модуля.Герметизация в сухой атмосфере позволяет установить матрицу на двухступенчатом элементе Пельтье, охлаждая детектор до температур примерно -15 ° C и тем самым снижая скорость счета в темноте (DCR) и повышая чувствительность прибора. Импульсы счета фотонов доступны извне через стандартный разъем SCSI. Это позволяет легко подключить модуль к платам общего назначения для сбора и обработки данных. В качестве альтернативы, встроенная ПЛИС (Spartan 6 SLX150, Xilinx, Сан-Хосе, Калифорния, США) может использоваться для подсчета отметок времени, обнаруженных в каждом из 48 каналов с временным разрешением 10 нс, где эта информация отправляется на удаленный ПК через высокоскоростной USB-канал.Крепление C в верхней части модуля счета фотонов позволяет легко и надежно подключаться к многоточечной установке.

Две матрицы SPAD, используемые в текущей 48-точечной установке smFRET-PAX, работают при температуре -10 ° C. Эффективность обнаружения фотонов (PDE) достигает максимума ~ 45% при 550 нм и падает до 35% при 628 нм ^23,24. PDE очень однороден по массиву с размахом от пика до пика всего в несколько процентов. На рис. 2 показаны тепловые карты темновых скоростей счета для двух массивов SPAD 12×4.Около 80% пикселей имеют DCR ниже 1000 импульсов в секунду (cps), тогда как пиксель с худшей производительностью имеет довольно низкий DCR менее 6 kcps.

Рис. 2.

Тепловые карты темновых скоростей счета (DCR) для массивов SPAD 12×4 D и A, используемых в текущей 48-точечной установке smFRETPAX. Значения DCR накладываются на каждый пиксель. Все значения даны в отсчетах в секунду (cps). Более подробную информацию и данные, лежащие в основе этого рисунка, можно найти на графиках DCR в записной книжке.

Результаты smFRET-PAX с 48 точками сравнивались с современной установкой μsALEX с одной точкой, описанной ранее в 14.В этой установке используются два однопиксельных коммерческих SPAD (SPCM-AQRH, Excelitas Technology Corp., Уолтем, Массачусетс, США), характеризующихся PDE, аналогичными нашим массивам SPAD в спектральном диапазоне D, но с более чем двукратным увеличением PDE в Спектральный диапазон. По этой причине ожидается, что установка μsALEX будет как минимум в два раза более чувствительной в A-канале, чем установка на 48 точек. Подробное сравнение различных технологий SPAD для измерения одиночных молекул приведено в 24.

B. 48-точечная диаграмма

48 точек возбуждения генерируются независимо для каждой длины волны посредством фазовой модуляции входящей плоской волны, как описано ранее. в 14 и 25.Фазовая модуляция работает в прямом пространстве, а не в пространстве Фурье, и реализует фазовый профиль матрицы линз Френеля. Группы Делона использовали концептуально аналогичную схему модуляции прямого пространства с использованием LCOS-SLM для мультиконфокальной флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS) ²⁶ (хотя они используют другое пространственное расположение фазовой структуры на LCOSSLM).

На рис. 3 показана диаграмма излучения зеленого (панель A) и красного лазеров (панель B), полученная камерой на боковом порте микроскопа с использованием высококонцентрированного образца красителя.Два шаблона выровнены для максимального перекрытия каждого из 48 точек. Перекрытие двух длин волн и центрирование по отношению к оптической оси оценивается с помощью 2-мерной гауссовой аппроксимации, как указано на панели C. Полная информация о процедуре выравнивания и оценке структуры может быть найдена в приложении A 1.

Рис. 3.

Многоточечный узор 12×4 для зеленого (A) и красного (B) возбуждения и гауссова подгонка пятен (C). Рисунок снимается камерой на боковом отверстии микроскопа (см. Рис.1) с использованием раствора красителей ATTO550 и ATTO647N в высокой концентрации (~ 100 нМ). Флуоресцентные изображения, полученные при возбуждении лазером 532 нм или 628 нм, были получены отдельно и представлены в зеленом и красном уровнях интенсивности на панелях (A) и (B), соответственно. Шкала 5 мкм. Для оценки совмещения каждое пятно на двух изображениях снабжено двухмерной функцией Гаусса. На панели (C) показано наложение подобранных положений пиков и контура гауссовой перетяжки для изображений 532 нм ( зеленый, ) и 628 нм ( красный, ).Справа показано увеличение для 3 репрезентативных точек. Эллиптическая форма и вращение гауссианы обусловлены геометрическими аберрациями. Более подробную информацию можно найти в записной книжке LCOS pattern fit-conf9_G_conf14_R_4x12_slits.

III. ИЗМЕРЕНИЯ SMFRET

A. Анализ

Измерения одиночных молекул проводили с образцами дцДНК из 40 пар оснований (п.н.), меченных красителями ATTO550 (D) и ATTO647N (A) (ATTOTEC GmbH, Гейдельберг, Германия), присоединенными к различным основаниям ДНК. , что дает разные расстояния между красителями.

D-A разделение 12 и 22 пар оснований (п.н.) использовалось в этих экспериментах, поскольку они покрывают типичный диапазон расстояний, которые могут быть точно измерены с помощью smFRET с использованием этой пары красителей. Образцы разбавляли до концентрации одной молекулы (~ 50 пМ) в буфере TE50 (10 мМ Tris pH 8,0, 1 мМ EDTA и 50 мМ NaCl). Полная информация об этих образцах представлена в исх. 14.

Мы проанализировали данные, используя стандартные методы μsALEX ²¹ с модификациями, необходимыми для smFRET-PAX ²⁰.Три этапа анализа: (a) оценка фона, (b) поиск пакета и (c) выбор пакета. Оценка фона, которая используется для корректировки количества вспышек в различных потоках фотонов, была выполнена в 10-секундных временных окнах, чтобы учесть возможные изменения во время измерения. Пакетный поиск выполнялся независимо для каждого пятна с использованием алгоритма скользящего окна ¹¹ и порога постоянной скорости для всех пятен ²⁷.

Основным результатом анализа μsALEX является так называемая гистограмма E-S, двумерная гистограмма, где каждый пакет представлен парой значений ( E, S ). E — это либо эффективность FRET, либо, чаще, нескорректированная эффективность FRET, известная как коэффициент близости, E _PR. E _PR легче вычислить и обеспечивает подходящее приближение для идентификации подгрупп. Однако, когда целью является извлечение расстояний D-A (что не является целью данного исследования), необходимо вычислить E , что потребует точной оценки всех поправочных коэффициентов. S — это «стехиометрический коэффициент», величина, идеально центрированная около 0.5 для видов с двойной меткой, 0 для видов только A и 1 для видов только D. Обратите внимание, что разновидности, содержащие только D и A, также включают молекулы с двойной меткой, где один краситель флуоресцентно неактивен либо в мигающем состоянии, либо в отбеленном. При использовании более простой версии без коррекции (ур. D8), S может зависеть от E , а для молекул с двойной меткой центрируется только приблизительно около 0,5. Использование пары ( E, S ) (скорректированная или нескорректированная) позволяет разделить виды с одной и двумя метками и выделить субпопуляции FRET в популяции с двойной меткой.Определение всех этих величин и сравнение с их аналогом ALEX приведены в приложении D.

В этой статье мы сообщаем коэффициенты близости E _PR , вычисленные в соответствии с ур. D6, и «модифицированное стехиометрическое соотношение» S _u , определенное в ур. D19. S _u представляет собой вариант классической стехиометрии smFRET-PAX ²⁰, которая снижает эффект дробового шума и улучшает разделение популяций только D и FRET.Более подробную информацию о S _и можно найти в приложении D1. Обратите внимание, что на протяжении всей этой работы результаты двух крайних левых точек во второй строке отсутствуют из-за сбоя активной схемы гашения (AQC) в массиве D-SPAD.

B. Пиковая скорость фотонов

Мы начинаем с анализа максимальной скорости фотонов, достигаемой в каждом всплеске, величины, которая масштабируется с пиковой интенсивностью PSF ¹⁴. На рис. 4 показана пиковая частота фотонов с поправкой на фон в каждой вспышке для 48 пятен.На панели A показаны полные распределения пиковых скоростей фотонов с их характерными экспоненциальными хвостами. Панели B-E показывают тепловые карты для различных потоков фотонов средних значений пиковой скорости фотонов, то есть константы затухания экспоненциального хвоста. Из-за гауссова профиля луча возбуждения и геометрических аберраций боковые пиксели получают более низкую интенсивность сигнала, чем центральные пиксели. В результате пиковая скорость фотонов уменьшается, и в боковых пятнах обнаруживается меньшее количество всплесков одиночных молекул.Хотя этот эффект снижает общую максимально достижимую пропускную способность, он не влияет на однородность логометрических величин E _PR и S в разных точках. Наоборот, на рис. 4 (панели C, E) мы наблюдаем, что пиксель в позиции (1, 7) в массиве A-SPAD систематически обнаруживает меньше фотонов, эффект приписывается более низкому PDE этого пикселя. Этот эффект вызывает смещение в количествах E _PR и S , как показано ниже.

Рис. 4.

Пиковая скорость фотонов в каждом из 48 пятен для образца дцДНК с разделением D-A 12 пар оснований. Панель A: полное распределение пиковых скоростей фотонов. Панели B-E: Среднее пиковое распределение скорости фотонов в различных потоках фотонов. Два боковых пятна во втором ряду не показывают сигнала из-за двух неисправных пикселей в массиве D-SPAD. Цветовая кодировка указывает на разные потоки фотонов. Зеленый D _ex D _em , красный D _ex A _em , голубой DA _ex D _em , фиолетовый DA _ex A _em .Подробнее см. Записную книжку smFRET-PAX_single_pop-2017-05-23_08_ 12d.

На рис. 5 показано распределение пиковых скоростей фотонов, полученных с помощью установки μsALEX. Сравнивая рис. 4 панели A и 5 видно, что снижение чувствительности в массиве A-SPAD приводит к более низким пиковым скоростям фотонов в D _ex A _em (красный) и DA _ex A _em ( фиолетовый) потоки в 48-точечной установке.

Рис. 5.

Распределение пиковых скоростей фотонов при измерении μsALEX в одной точке образца дцДНК с разделением D-A 12 п.н.Цветовая кодировка указывает на разные потоки фотонов. Зеленый D _ex D _em , красный D _ex A _em , фиолетовый A _ex A _em . Подробнее см. Записную книжку μs-ALEX_analysis-2017-06-11_000_12d.

C. Гистограммы E-S

После первоначального поиска пакета необходимо применить критерий выбора пакета, чтобы отклонить самый маленький пакет, который доминирует в распределении. На рис. 6 показана гистограмма E-S для образца дцДНК с разделением D-A 12 п.н. после выбора пакетов с количеством фотонов из всех потоков, превышающих пороговое значение.Мы наблюдаем, что популяции D-only и FRET (соответственно верхний левый угол и центр на 2-мерной гистограмме) четко различимы в большинстве каналов. Более того, как показано на рис. 7, легко выделить совокупность FRET, применив пакетную выборку к счетчикам DA _ex A _em и D _e x счетам. Отделение FRET от однократно меченых частиц является основным преимуществом двойного лазерного возбуждения.

Рис. 6. Гистограммы

E _PR и S _u для различных пятен в образце дцДНК с разделением D-A 12 п.н.Видны две субпопуляции: только D (около E _PR = 0, S _u = 1) и популяция FRET (около E _PR = 0,6, S _u = 0,6 ). Поиск пакета был выполнен с использованием всех фотонов с постоянным порогом поиска пакета (50 kcps). Выбор пакета был выполнен по общему размеру пакета после коррекции фона с использованием порога в 40 фотонов. Легенда на каждом подзаголовке сообщает номер пятна ([·]) и количество пакетов (#B).Подробнее см. Записную книжку smFRET-PAX_single_pop-2017-05-23_08_12d.

Рис. 7. Гистограммы

E _PR и S _u для различных пятен в образце дцДНК с разделением D-A 12 п.н. Анализ данных и поиск пакетов идентичны показанным на рисунке 6, в то время как выбор пакета был адаптирован для выбора только популяции FRET: пакет выбирается, если количество отсчетов в D _ex DA _em и DA _ex Оба потока _em больше 20.Легенда на каждом подзаголовке сообщает номер пятна ([·]) и количество всплесков (#B). Подробнее см. Записную книжку smFRET-PAX_single_pop-2017-05-23_08_12d.

Без дополнительной калибровки разброс по различным каналам ограничен и не влияет на способность различать субпопуляции. Это очевидно на фиг. 8, на которой показаны положения центра пиков E _P R и S _u в разных точках как для популяций D-only, так и для FRET. Инжир.9 показан центр и диапазон ± 1 σ подобранных пиков E-S для популяции FRET (синяя точка и полоса ошибок) для каждого канала. Оранжевая точка — это среднее положение центрального пика популяции FRET по всем точкам. Следует отметить, что почти для всех каналов отклонение положения пика намного ниже диапазона ± 1 σ , за исключением канала 19, где более низкое PDE пикселя A вызывает большее отклонение от положения пика. На рис. 8 и 9 мы представляем результаты без калибровки канала с целью иллюстрации необработанных характеристик системы.Однако можно уменьшить межканальные вариации положения пика E-S, применив калибровку для каждой точки, кратко описанную в следующем разделе (с полной информацией в приложении E). Для сравнения, гистограмма E-S для дцДНК с низким FRET (разделение D-A 22 п.н.) представлена в приложении F, рис. 13.

Рис. 8. Диаграмма рассеяния

подобранного пика E _PR, S _u в различных точках для популяций только D (, оранжевый крест, ) и FRET ( синий плюс ).Значения были получены путем простой гауссовой аппроксимации одномерной гистограммы E _PR и S _и после выборки всплесков, которая изолировала популяции только D и FRET, соответственно. Подробнее см. Блокнот smFRETPAX_single_pop-2017-05-23_08_ 12d.

Рис. 9.

Положение пика подогнанного FRET ( E _PR, S _u, синие точки ) и ± 1 σ подогнанного гаусса ( синие полосы ошибок ) для 48 точек.Для справки, среднее значение E _PR, S _и по 48 точкам ( оранжевая точка ) указано на каждом подграфике. Номер точки указан в верхнем правом углу каждого участка. Подробнее см. Записную книжку smFRET-PAX_single_pop-2017-05-23_08_12d.

D. Объединение данных со всех каналов

Чтобы проиллюстрировать высокую пропускную способность 48-точечной системы, мы построили гистограмму ALEX, накапливающую пакеты из всех точек в течение короткого временного окна в 15 с (рис.10). В принципе, неоднородности между различными каналами могут быть учтены путем разложения γ и β на два фактора: один является средним значением для всех пятен, а другой является «относительной» корректировкой для каждого пятна. Компонент для каждой точки для γ и β может быть легко вычислен из измерения статического образца FRET (подробности в приложении E). На рис. 10 для простоты и из-за хорошей однородности по пятнам мы приводим необработанные значения E _PR и S _u без каких-либо корректировок для конкретных участков.

Рис. 10. Гистограмма

Multispot ALEX, полученная за 15 секунд сбора данных путем объединения пакетов из всех 48 точек. Подробнее см. Записную книжку smFRET-PAX_single_pop-2017-05-23_08_12d.

Для сравнения на рис. 11 показана аналогичная гистограмма, полученная путем накопления всплесков в течение 15 с во время измерения того же образца с использованием одноточечной установки μsALEX. Хотя мы наблюдаем, что общее количество всплесков, обнаруженных при многоточечном измерении, примерно в 12 раз больше, чем при однократном измерении, количественное сравнение не может быть выполнено, потому что измерения проводились при разных разбавлениях в двух установках.Помимо сложности контроля концентрации образца с высокой точностью, есть и другие причины, по которым число вспышек не может точно соответствовать количеству пятен. Во-первых, в многоточечной установке сложно оценить мощность в каждом пятне, потому что интенсивность неоднородна, а боковые пятна получают меньшую мощность. Мощность откалибрована таким образом, что в центральных точках мы получаем сигнал в D-канале, сравнимый с измерениями в одной точке (которые использовали 180 мкВт при 532 нм).Боковые пятна получают меньшую мощность и, следовательно, обнаруживают меньшее количество пакетов. Во-вторых, эффективность обнаружения массива SPAD в красной области электромагнитного спектра ниже, чем у соответствующего SPAD в одноточечной установке (см. Раздел II A), что уменьшает общий размер пакета и, следовательно, количество пакетов, выбранных с помощью заданный порог.

Рис. 11. Одноточечная гистограмма ALEX

, полученная за 15 с сбора данных для той же выборки, что и на рис. 10. Для получения дополнительных сведений см. Записную книжку us-ALEX_analysis-2017-06-11_000_12d.

Рис. 12.

Экспериментальные координаты пикселей SPAD после точного выравнивания для массивов D-SPAD и A-SPAD. Центральные положения D-SPAD обозначены «X», а центральные положения A-SPAD обозначены «+».

Рисунок 13.

E _PR в сравнении с S _u гистограммы всех пятен для образца 22d дцДНК. Анализ данных и поиск пакета идентичны показанным на рисунке 6. Поиск пакета был выполнен с использованием всех фотонов с постоянным порогом поиска пакета (50 kcps).Выбор пакета был выполнен по общему размеру пакета после коррекции фона с использованием порога в 40 фотонов. Легенда на каждом подзаголовке сообщает номер пятна ([·]) и количество пакетов (#B).

IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы описали новую установку FRET для одиночных молекул с 48 точками, предназначенную для высокопроизводительных анализов одиночных молекул. По сравнению с нашей предыдущей многоточечной установкой ¹⁴ количество точек было увеличено в шесть раз с соответствующим увеличением пропускной способности. Хотя были продемонстрированы более крупные массивы SPAD, они изготавливаются с использованием стандартных высоковольтных КМОП-процессов, что приводит к худшим характеристикам подсчета фотонов, чем применяемый здесь специализированный технологический процесс.Убедительные применения в клеточной FCS и FLIM, среди прочего, были опубликованы с этими массивами CMOS SPAD ^28–32 (подробный обзор см. 33), но они все еще далеки от обеспечения чувствительности, необходимой для одномолекулярных приложений. .

По сравнению с нашими предыдущими работами ^14,34, был включен второй лазер с переменным возбуждением, и соответствующие препятствия для выравнивания были решены, что позволило сортировать одиночные молекулы в соответствии с их стехиометрией D-A.В частности, мы показали, что установка позволяет идентифицировать виды с одной и двумя метками во всем диапазоне эффективности FRET, открывая дверь для гораздо более широкого диапазона анализов, чем это было возможно ранее.

Мы представили подробное описание процедуры настройки и юстировки многоточечной системы, которая включает ряд технических решений, потенциально интересных для других приложений. Мы также проиллюстрировали возможности измерения sm-FRET новой установки с использованием молекул дцДНК с двойной меткой в качестве доказательства принципиальной демонстрации разделения субпопуляций и высокопроизводительных измерений.Наконец, мы сравнили его характеристики со стандартной одноточечной (конфокальной) установкой μsALEX. Применение этого нового инструмента для изучения начальных стадий бактериальной транскрипции и высокопроизводительной диагностики будет изучено в будущей работе.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы благодарят Луку Миари за помощь на начальном этапе этого проекта, г-на Язана Альхадида и доктора Эйтана Лернера за помощь с подготовкой одномолекулярных образцов и доктора Эйтана Лернера за критическое прочтение рукописи.Мы благодарим доктора Бентолилу за щедрую ссуду LCOS SLM от Фонда общих ресурсов Advanced Light Microscopy / Spectroscopy в Калифорнийском институте наносистем в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе. Исследования, представленные в этой публикации, были поддержаны Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения (номер награды R01GM095904 и R01 GM069709) и Национальным научным фондом (номер награды MCB 1244175). Ответственность за содержание несут исключительно авторы. и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения или Национального научного фонда.Заявления о конфликте интересов: S. Weiss раскрывает информацию об интеллектуальной собственности, использованную в исследовании, о котором идет речь. Работа в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе проводилась в лаборатории доктора Вайса. М. Гиони раскрывает долю в Micro Photon Devices S.r.l. (MPD). В этой работе не были задействованы ни ресурсы, ни персонал MPD.

ПРИЛОЖЕНИЕ A Подробное описание установки

Установка (рис. 1) состоит из двух непрерывных лазеров возбуждения на 532 нм и 628 нм (2RU-VFL-Series, MPB Communications Inc., QC, Канада). Для каждого лазера полуволновая пластина и поляризационный светоделитель используются для управления поляризацией и интенсивностью, так как ориентация поляризации должна быть выровнена в направлении, требуемом LCOS-SLM.Лазер с длиной волны 628 нм направляется через акустооптический модулятор (P / N 48058 PCAOM, электроника: P / N 64048-80-.1-4CH-5M, Neos Technology, Мельбурн, Флорида, США), используемый для шкалы времени в мкс. модуляция, а лазер 532 нм не модулируется. Каждый лазер проходит через первый расширитель луча (телескоп Кеплера, дуплетные линзы: фокусные расстояния 50 мм и 250 мм). Два перископа направляют лучи на приподнятый оптический макет, где корпус микроскопа (X71, Olympus Corporation, Япония) закреплен так, чтобы его нижний порт находился над круглой апертурой.Помимо перископа, каждый луч проходит через второй регулируемый расширитель луча (3X, P / N 59-131, Edmund Optics Inc.). Красный лазер отражается от зеркал M 1 _R и M 2 _R и модулируется по фазе «красным» LCOS-SLM (P / N X10468-07, Hamamatzu, Япония) , перед прохождением через дихроичное зеркало D _MIX. Зеленый лазер отражается от M 3, модулируется по фазе «зеленым» LCOS-SLM (P / N X10468-01, Hamamatzu) и объединяется с красным возбуждением через дихроичное зеркало D _MIX (T550LPXR, Chroma Technology Corp, VT, США).Оба луча повторно коллимируются линзой L ₃ (f = 250 мм, AC508-250-A, Thorlabs) и фокусируются в образец линзой объектива с высокой числовой апертурой (UAPOPlan 60x, NA 1.2, Olympus) после отражается от возбуждающего дихроичного зеркала DM _EX (Brightline FF545 / 650-Di01, Semrock Inc., Нью-Йорк, США). Схема возбуждения формирует двухцветный массив пятен 12×4 в образце, соответствующий геометрии двух массивов SPAD. Эмиссия флуоресценции собирается той же линзой объектива, проходит через дихроичный возбуждающий DM _EX и фокусируется линзой трубки микроскопа L ₂ либо на боковом, либо на нижнем порте микроскопа.Боковой порт служит для установки камеры sCMOS (Grasshopper3 GS3-U3-23S6M-C, FLIR Integrated Imaging Solutions Inc., Британская Колумбия, Канада), используемой во время юстировки, а нижний порт перенаправляет лучи на путь излучения. Здесь релейная линза L 4 (f = 100 мм, AC254-100-A, Thorlabs) восстанавливает изображение и отправляет его на эмиссионное дихроичное зеркало D _EM (Brightline Di02-R635, Semrock), которое разбивает сигнал на донорные (D) и акцепторные (A) спектральные полосы. Путь D проходит через полосовой фильтр (Brightline FF01-582/75, Semrock), который устраняет остаточную утечку лазера с длиной волны 628 нм и помогает подавить рамановское рассеяние от лазера с длиной волны 532 нм.Оба пути D и A перефокусированы линзами L 5 _D / L 5 _A (f = 150 мм, AC254-150-A, Thorlabs) на двух 48-пиксельных массивах SPAD ²³ (в тексте обозначены буквами D и A SPAD).

Обе матрицы SPAD установлены на 3-осевом микропозиционере. Направления, ортогональные оптической оси (X-Y), управляются программно с помощью пьезоприводов с разомкнутым контуром (исполнительные механизмы: Newport 8302; драйверы: Newport 8752 и 8753; Newport Corporation, Ирвин, Калифорния, США).Третья ось (Z) имеет ручные приводы, поскольку требования к направлениям Z гораздо менее строгие, чем к направлениям X-Y. Массив D-SPAD имеет дополнительный столик для вращения вокруг оптической оси, который используется для согласования относительной ориентации массивов SPAD. Программное обеспечение для управления микропозиционерами доступно в репозитории Picomotor.

Каждый модуль массива SPAD оснащен внутренней FPGA (Xilinx Spartan 6, модель SLX150), датчиком влажности и разъемом USB 2.0.Используемая в этой работе прошивка ПЛИС по умолчанию позволяет получать отсчеты с временным интервалом с низким разрешением (10–100 мс) через USB-соединение, которое также используется для мониторинга влажности. Кроме того, стандартный разъем SCSI включает 48 независимых выходов, обеспечивающих импульс для каждого обнаруженного фотона в каждом пикселе ²³. Два порта SCSI подаются через специальный адаптер к плате сбора данных на базе FPGA (плата FPGA: PXI-7813R, стойка: PXI-1000B, National Instruments, Остин, Техас), которая выполняет временную метку с помощью 12.Разрешение 5 нс параллельно на 96 каналах (задача реализована в LabVIEW 2011 с использованием FPGA Toolkit, код доступен здесь). Плата FPGA передает данные асинхронно на главный компьютер через канал MXI-4 в пользовательскую программу сбора данных, написанную в LabVIEW 2011 (ссылка MXI-4: плата стойки PXI-8331; плата ПК PCI-8331, National Instruments). Программа сбора данных также управляет чередованием красного лазера с помощью платы генерации импульсов (PXI-6602, National Instruments), часы которой синхронизируются с платой FPGA с отметками времени (PXI-7813R) через общую линию шины на стойке (PXI-1000B).

В дополнение к вышеупомянутой программе сбора данных на главном компьютере выполняется вторая программа LabVIEW 2011, управляющая фазовой диаграммой на двух LCOSSLM. Во время юстировки программа сбора данных взаимодействует с программой управления LCOS для сканирования положений шаблона LCOS и оценки положения массивов SPAD (см. Приложение B).

Необработанные двоичные данные сохраняются вместе с текстовым файлом метаданных, содержащим детали измерений, которые используются для создания окончательного файла Photon-HDF5 ^35,36.После сохранения измерения на главном ПК необработанные данные немедленно передаются на рабочую станцию на базе Linux по каналу Ethernet 1 Гбит / с. Вторая рабочая станция автоматически выполняет преобразование в Photon-HDF5 и анализ данных, оставляя главный компьютер доступным для получения следующего набора данных. Скрипты для преобразования и анализа передачи данных доступны в репозитории transfer_convert.

1. Модуляция LCOS-SLM

Массив из 48 пятен возбуждения генерируется независимо для каждого цвета двумя LCOS-SLM посредством фазовой модуляции входящей плоской волны, как ранее описано в пп. 14 и 25.Вкратце, LCOS-SLM реализует в прямом пространстве фазовый профиль массива линз, который фокусирует массив пятен в плоскости изображения LCOS на расстояниях 3-4 см от поверхности модулятора (см. Рис. 1). Прямоугольная область LCOS-SLM разделена на смежные блоки 12×4, каждый из которых реализует одну линзу. Шаблон можно регулировать, изменяя его центральное положение, вращение и шаг по осям X и Y независимо (операции, эквивалентные смещению, повороту или растяжению массива линз). Для обеих длин волн возбуждения шаг и, следовательно, диаметр линз определяются геометрией детектора и увеличением оптической последовательности от LCOS-SLM до детектора.Шаг пятна на образце, который номинально соответствует геометрии детектора, составляет 5,5 мкм (500 мкм м / 90) в каждом направлении, что приводит к шагу линзы LCOS-SLM 463 мкм (23,1 пикселя LCOS-SLM). Это значение оптимизируется во время юстировки, чтобы соответствовать фактическому увеличению и оптическим аберрациям. При сохранении постоянного диаметра и шага линз LCOS изменение фокусного расстояния приводит к изменению числовой апертуры и, следовательно, размера пятна. Соотношение фокусных расстояний в двух LCOS-SLM (32 мм для красного и 36 мм для зеленого) выбрано для компенсации разницы в размерах PSF между длинами волн 532 нм и 628 нм.

Область LCOS-SLM, окружающая шаблон 12×4, принимает свет, который может привести к рассеянному «широкопольному» возбуждению и, следовательно, к сильному фону. По этой причине мы заполняем неиспользуемую область LCOS-SLM шаблоном «управления лучом» (периодическим шаблоном в одном направлении), который дифрагирует падающий свет под углом по отношению к оптической оси. Такое «управление» гарантирует, что свет, не влияющий на многоточечный рисунок, не будет собираться задней апертурой линзы объектива.Кроме того, расширенный лазерный луч ограничивается двумя прямоугольными отверстиями (щелями), которые примерно на 1 мм больше, чем рисунок с несколькими пятнами, дополнительно уменьшая свет, который в противном случае влияет на фон. Этот подход обеспечивает низкий фон без необходимости в дополнительном пространственном фильтре, как в нашей предыдущей установке ¹⁴.

Аналогичный подход для генерации мультиспотов используется в мультиконфокальной FCS группы Делона ²⁶. Важное отличие состоит в том, что они используют гораздо большее фокусное расстояние LCOS для построения однофазной диаграммы для всех пятен (как суммы вкладов каждого отдельного пятна).И наоборот, в нашем подходе разные части LCOS-SLM распределяются по разным точкам. Насколько нам известно, подробное экспериментальное сравнение, подчеркивающее относительную силу этих двух подходов, в настоящее время отсутствует.

Программное обеспечение, используемое для генерации многоточечного фазового шаблона, используемого в этой работе, доступно в репозитории lcos_multispot_pattern.

Приложение B Юстировка лазера

Каждый из двух лазеров необходимо юстировать, чтобы обеспечить (а) максимальную однородность между интенсивностями пятна (б) минимальные аберрации по рисункам.Для достижения (а) гауссова лазерного луча расширяют так, чтобы только центральная часть луча покрывала диаграмму возбуждения (которая имеет максимальную протяженность 5 мм). Для обеспечения (b) геометрический центр рисунка должен быть размещен на оптической оси.

Кроме того, (c) диаграмма возбуждения двух лазеров должна быть выровнена так, чтобы было максимальное перекрытие между объемами возбуждения D и A для каждого пятна.

1. Индивидуальная юстировка лазера

Монолитные расширители луча 3X имеют регулировочное кольцо, используемое для управления коллимацией луча.Простой способ обеспечить коллимацию луча — направить луч в микроскоп через дихроичное зеркало возбуждения, снять внешнюю реколлимационную линзу L 3 и линзу объектива, одновременно поместив зеркало на держатель образца и используя LCSO-SLM в качестве зеркало т.е. с постоянной фазовой диаграммой. Используя камеру на выходном порте микроскопа, мы регулируем коллимацию до тех пор, пока не образуется плотное пятно. После настройки коллимации каждый луч должен быть выровнен так, чтобы пиковая интенсивность находилась в центре оптической оси.С этой целью без реколлимационной линзы L 3 диафрагма I 2 помещается до того, как луч попадет в боковой порт микроскопа. При апертуре 1-2 мм только узкий луч проходит через объектив и генерирует пятно от отражения покровного стекла. Только когда входной луч параллелен оптической оси, пятно в центре поля зрения считается расположенным в центре перекрестия в окуляре микроскопа. Чтобы сделать входные лучи параллельными оптической оси, последние зеркала перед микроскопом настраиваются ( M 2 _R для красного и DM _MIX для зеленого лазера).Расфокусируя пятно, мы получаем симметрично концентрические узоры только в том случае, если входной бимлет пересекает оптическую ось на задней апертуре линзы объектива. Поскольку направление уже зафиксировано, мы перемещаем диафрагму I 2, чтобы получить наиболее радиально-симметричный расфокусированный узор. Таким образом, луч, проходящий через I 2, совпадает с оптической осью микроскопа. Последним шагом является перемещение входного луча без изменения его угла падения до тех пор, пока пик интенсивности не будет совмещен с центром диафрагмы.Совмещение направления луча и диафрагмы необходимо повторять до схождения. После завершения оба луча параллельны и концентричны с оптической осью в хорошем приближении. При размещении L 3 пятно формируется в другом положении фокусировки. L 3 можно выровнять, гарантируя, что это новое пятно находится в том же положении, что и пятно, полученное без L 3.

2. Достижение перекрытия зеленого и красного шаблонов

Начиная с зеленого LCOS-SLM, мы спроецировать рисунок с множеством пятен в высококонцентрированный раствор красителей (100 нМ — 1 мкМ), используемый для выравнивания.Использование квадратной сетки пятен с нечетным количеством пятен на каждой стороне (например, 9×9) гарантирует, что одно пятно окажется в центре узора. Камера на боковом порте обнаруживает изображение узора. Центрирование рисунка относительно оптической оси можно оценить по количеству геометрических аберраций в боковых пятнах. Мы центрируем схему возбуждения, жестко перемещая узор на LCOS-SLM, так что геометрические аберрации примерно эквивалентны с четырех сторон. Затем мы выполняем двухмерную гауссову подгонку каждого пятна и по распределению сигм и вращению каждого гаусса мы оцениваем более точное положение оптической оси (для анализа см. Блокнот LCOS pattern fit-conf9_G_conf14_R_4x12_slits).Этот шаг можно повторять несколько раз до схождения. С этого момента положения X-Y зеленого LCOS-SLM больше не меняются, и его центр становится точкой отсчета для положения оптической оси.

Затем мы активируем красный LCOS-SLM и проецируем многоточечный узор, возбуждаемый лазером с длиной волны 628 нм. Используя камеру, мы выравниваем красный узор с зеленым, используемым в качестве ориентира. Первоначальная грубая настройка красной диаграммы направленности LCOS-SLM выполняется вручную путем наблюдения диаграммы направленности излучения на дисплее камеры в реальном времени.Затем центральное положение красного шаблона LCOS-SLM точно регулируется путем подгонки положений пятен на зеленом и красном изображениях (рис. 3), взятых отдельно (записную книжку для анализа можно найти в программном обеспечении multispot).

Наконец, чтобы уменьшить фон из-за немодулированного света, на пути перед каждым LCOS добавлены две специально изготовленные прямоугольные щели (алюминий с черным покрытием) ( S _R и S _G на рис.1). Щели выровнены так, чтобы освещать только рисунок 12×4 (± 1 мм) на LCOSSLM (см. Приложение A 1).

Приложение C Выравнивание массивов SPAD

Оба детектора должны быть выровнены так, чтобы каждый пиксель был оптически сопряжен с соответствующим объемом возбуждения (PSF возбуждения). Цель состоит в том, чтобы иметь пары соответствующих пикселей на двух массивах, обнаруживающих фотоны из одного и того же объема образца (обнаружение PSF). В то же время, чтобы сигнал был максимальным, PSF детектирования должен быть концентричным с PSF возбуждения. Достижение этого с помощью 2-мерного расположения пятен и пикселей требует не только выравнивания положения детекторов по оси XY, как при одноточечных измерениях, но также выравнивания относительного вращения двух SPAD и регулировки шага и поворота шаблона возбуждения. для оптимального соответствия геометрии детекторов.

Для выравнивания мы используем смесь красителей с высокой концентрацией (ATTO550, ATTO647N, ~ 500 нМ), возбуждаемую обоими лазерами. В этом образце лазер с длиной волны 532 нм генерирует сигнал флуоресценции в обоих каналах D и A, тогда как лазер с длиной волны 628 нм генерирует сигнал только в канале A. На данный момент положение шаблонов возбуждения 532 нм и 628 нм на LCOS-SLM уже зафиксировано, чтобы минимизировать геометрические аберрации, как описано в приложении B. Поэтому положение шаблона возбуждения используется в качестве ориентира для выравнивания Массивы SPAD.Tyndall et al. ³⁷ представили автоматическую процедуру для совмещения многоточечного шаблона LCOS-SLM с детектором. Здесь мы выравниваем SPAD по шаблону LCOS-SLM. Начиная только с зеленым лазером, оба SPAD вручную позиционируются по осям X и Y, чтобы соответствовать центру схемы возбуждения. Это достигается за счет максимизации временных интервалов счетчиков SPAD, отображаемых программой сбора данных при перемещении детекторов.

Затем мы выполняем более автоматизированную процедуру точного выравнивания, называемую «сканирование нескольких точек».Многоточечное сканирование включает в себя жесткое преобразование многоточечного рисунка на LCOS-SLM (обычно пятна 4×4) дискретными шагами вдоль двух ортогональных сегментов, формируя перекрестный путь. В то же время счетчики из массива SPAD интегрируются для каждой позиции шаблона более 300 мс. Во время сканирования каждое пятно излучения рисует поперечный путь примерно с центром в пикселе SPAD. Типичное сканирование охватывает диапазон из 10 пикселей LCOS-SLM с размером шага 0,4 и выполняется последовательно по направлениям X и Y. Подсчеты, полученные как функция положения LCOS-SLM, напоминают профиль пика, который используется для оценки положений центров пикселей SPAD в координатах LCOS-SLM.Усредняя положение пикселей SPAD, мы получаем точную оценку для центра массива SPAD. В конечном итоге эта процедура дает смещение каждого массива SPAD относительно идеального центра диаграммы направленности возбуждения. Обладая этой информацией, мы перемещаем массивы SPAD в идеальное положение X-Y с помощью пьезопозиционеров с программным управлением. Последовательность многоточечного сканирования и трансляции массива SPAD повторяется до схождения. Первоначально две матрицы SPAD выровнены относительно зеленого шаблона LCOS-SLM (532 нм).Затем положение красного шаблона LCOS-SLM (628 нм) настраивается так, чтобы оно соответствовало положению массива A-SPAD, и массив D-SPAD не обнаруживает никаких сигналов с возбуждением 628 нм. Оптимальное положение красного шаблона возбуждения определяется из многоточечного сканирования, выполняемого с помощью красного LCOS-SLM, в то время как счет производится с помощью массива A-SPAD. После этого фиксируются как красные и зеленые шаблоны возбуждения, так и положения массива D / A-SPAD, и выравнивание завершается.

Вся процедура точной юстировки обычно выполняется в начале каждого дня измерений и длится около 30 минут.На рис. 12 показаны подогнанные координаты после точного совмещения центрального набора пикселей 4×4 в массивах D и A-SPAD.

1. Вращение и регулировка шага

В предыдущем разделе мы в общих чертах описали общую процедуру точного выравнивания, повторяемую ежедневно при использовании многоточечной настройки. Однако при построении установки необходимы дополнительные шаги (а) для выравнивания относительного вращения двух массивов SPAD, (б) для определения наилучшего шага по осям X и Y для зеленого и красного паттернов возбуждения и (в) для того, чтобы оптимизировать положение SPAD вдоль оптической оси (Z).

Для получения информации о вращении и шаге мы выполняем многоточечное сканирование, за которым следует дополнительный этап анализа. В частности, набор положений X-Y каждого пикселя SPAD, полученного в результате сканирования, соответствует прямоугольной сетке. Параметры подобранной сетки: положение центра, шаг по оси X, шаг по оси Y и угол поворота. Каждый массив SPAD будет иметь свой набор подходящих параметров.

Чтобы отрегулировать угол поворота, один из массивов SPAD (D) вращается вокруг оптической оси, чтобы соответствовать углу второго SPAD, где угол поворота каждого SPAD получается из результатов сканирования.Как только ориентации двух массивов SPAD совпадают, этап вращения блокируется, обеспечивая долгосрочную стабильность угла поворота.

Что касается высоты тона, информация из подгонок сканирования используется для точной настройки шага X и Y шаблона LCOS-SLM, который оптимально соответствует обоим массивам SPAD. Мы наблюдали разницу в шаге X и Y на 1-2% из-за неидеальности из-за стигматизма на оптическом пути.

Приложение D ALEX и PAX

В ALEX задействованы два периода чередования D _ex и A _ex (соответственно D или A возбуждение) и два детектора (D и A).Это приводит к четырем основным потокам фотонов с именами D _ex D _em, D _ex A _em, A _ex D _em, A _ex A _em , где первый символ указывает период возбуждения, а второй — канал обнаружения. Поток A _ex D _em содержит только фон, потому что нет флуоресцентного излучения в D-спектральной полосе во время возбуждения A-лазера. Для простоты здесь мы предполагаем, что эти величины были скорректированы с учетом фона ²⁷.

В установке PAX есть два детектора (D и A), но только один чередующийся лазер (A). Мы определяем два периода: один, когда включен только D-лазер ( D _ex ), и один, когда оба лазера включены ( D A _ex ). Как и в ALEX, объединение двух периодов возбуждения и двух детекторов приводит к четырем основным потокам фотонов PAX: D _ex D _em, D _ex A _em, DA _ex D _em, DA _из A _из. Формально единственная разница с потоком фотонов ALEX состоит в том, что A _ex в ALEX заменяется на DA _ex в PAX. Однако, в отличие от ALEX, все четыре потока фотонов в PAX содержат полезный флуоресцентный сигнал. В частности, DA _ex D _em содержит D-флуоресценцию из-за возбуждения D-лазера, тогда как соответствующий член A _ex D _em в ALEX содержит только фон. С помощью этого обозначения, как в ALEX, так и в PAX, мы можем определить общий сигнал флуоресценции во время D-возбуждения (например,г. размер пакета): где величины F — это количество фотонов с поправкой на фон. F _FRET — флуоресценция A из-за FRET, вычисленная путем вычитания D-утечки и A-прямого возбуждения из FD _ex A _em:

Нам также нужны обычные поправочные коэффициенты γ и β ²¹: где ϕ _A, ϕ _D — квантовые выходы красителя и PDE каналов D и A.В ур. D4, и — интенсивности A- и D-возбуждения, а и — сечения поглощения красителя на соответствующих длинах волн лазера. β учитывает разницу флуоресценции D- и A-красителей, когда каждый краситель возбуждается соответствующим лазером.

Мы можем определить полный сигнал с поправкой на γ как ^21,38:

В отличие от Λ, величина Λ _γ не изменяется с FRET (до тех пор, пока не меняется квантовая эффективность красителей).

С этими определениями мы можем записать выражение для коэффициента близости E _PR и эффективности FRET E , которое справедливо как для ALEX, так и для PAX:

И наоборот, выражение S немного отличается для ALEX и PAX.В ALEX мы определяем S и исправленную версию S _γβ как:

Значение S _γβ всегда центрируется около 0,5 для видов с двойной меткой, независимо от эффективности FRET или D- и A-возбуждения. интенсивности.

В PAX мы не измеряем напрямую, но можем вычислить его как:

Заменив выражения PAX для S и _Sγβ становятся формально идентичными уравнению. D8 и D9:

В PAX мы можем воспользоваться преимуществом дополнительного сигнала в и получить эквивалентный набор расширенных PAX выражений для E, и S. Мы можем начать расширять определения общего сигнала FRET уравнения. D1 и D5, включив следующее:

На основе ур. D13 и D14, мы можем написать PAX-расширенные выражения для E и S:

Eq. D15, D16, D17 и D18 содержат больше фотонов, чем классические выражения, и, следовательно, могут привести к более низкому дробовому шуму. Однако этот эффект смягчается тем фактом, что F _{F RET} подсчитывается дважды, чтобы компенсировать удвоение сигнала D, и, следовательно, его дробовой шум усиливается.

1. Модифицированная стехиометрия

Заменив на в ур. D11, мы определяем «модифицированную стехиометрию» S _u , используемую в этой статье, как:

Это выражение позволяет избежать вычитания количества фотонов (и соответствующего увеличения дробового шума), необходимого в PAX для вычисления (уравнение D10 ). В результате распределения S _и стали более жесткими, что упрощает разделение популяции FRET и только D. Однако обратите внимание, что S _u имеет встроенную зависимость от значения FRET популяции, в частности S _u уменьшается с увеличением E. В этой работе, даже при низких значениях FRET, лучшее разделение между FRET и популяцией только D было достигнуто с использованием S _u вместо S. В целом, предпочтение S _u по сравнению с S. может измениться в других установках PAX, когда отношения сигнал-шум и фон-шум значительно выше. После разделения популяций можно вернуться к классическому выражению S для вычисления гамма-факторов.В данной статье мы интересовались не восстановлением абсолютных значений FRET и расстояний D-A, а демонстрацией возможностей системы smFRET-PAX с точки зрения равномерности точек и увеличения пропускной способности. Поэтому мы не выполняли полную калибровку гамма-фактора. Однако мы рассмотрели различия в эффективности сбора и обнаружения в разных точках, используя «относительный» гамма-коэффициент χ _ch , как показано в разделе E.

Приложение E Поправки для отдельных каналов

1.Гамма-коррекция

Гамма-фактор каждого канала, γ _ch , может быть выражен как произведение среднего коэффициента γ _m и поправочного коэффициента для конкретной точки χ _ch :

χ _ch можно легко вычислить из измеряемых величин в соответствии со следующим выражением:

In eq. E2, E _PRch — это коэффициент близости на уровне популяции для определенного канала, а 〈 E _PRch 〉 _ch — среднее значение по всем каналам N (в данном случае N = 48).

Ур. E2 следует из следующего соотношения между E и E _PR ^21,38:

Решение уравнения. E3 для γ , получаем:

Формально можно записать γ = γ ₁ γ ₂, где γ ₁ связано с частично скорректированным коэффициентом близости E ₁ следующим образом:

Записав γ ₁ как функцию от E ₁ как в E ₄ и подставив выражение в ур.E3, мы получаем E как функцию E ₁:

Ур. E6 имеет ту же форму, что и E3 и E6. Следовательно, E может быть получено двумя последовательными (связанными) поправками для γ ₁ и γ ₂ соответственно, как в уравнении. E7.

В случае с несколькими точками мы применяем это свойство, чтобы разложить гамма-коррекцию на коррекцию, специфичную для точки, и среднюю коррекцию, как в E1. В частности, ур. E2 напрямую происходит от E4 с простыми заменами.

Приложение F Дополнительные данные

На рис. 13 показаны гистограммы E _PR -S _u для различных каналов, полученные во время измерения образца ДНК 22d (низкий FRET). Из-за выбора мощности возбуждения донора и акцептора во время этого измерения популяция FRET имеет значение S _и больше 0,5, искусственно сжимая гистограммы в верхней части графиков. Тем не менее, все еще возможно отличить FRET от пакетов только D, несмотря на низкое значение E _PR для этого образца, что позволяет без смещения оценить E _PR , в отличие от того, что было бы произошло в отсутствие акцепторного возбуждения ¹⁴.

Сноски

↵a) Электронная почта: ingargiola.antonino {at} gmail.com
b) Электронная почта: michalet {at} chem.ucla.edu

ССЫЛКИ

↵
↵
↵
↵
↵
А. Ингаргиола, Р. А. Кольер, Д. Ким, Ф. Панцери, Р. Линь, А. Гулинатти, И. Реч, M. Ghioni, S. Weiss и X. Michalet, in Proceedings of SPIE, Vol.8228 (SPIE, Сан-Франциско, Калифорния, США, 2012) стр. 82280B.
A. Ingargiola, F. Panzeri, N. Sarkosh, A. Gulinatti, I. Rech, M. Ghioni, S. Weiss и X. Michalet, in Proceedings of SPIE, Vol. 8590 (Сан-Франциско, Калифорния, США, 2013 г.) стр. 85900E.
↵
↵
↵
↵
↵
↵
↵
↵
↵
↵
A. Rechulinatti, I.Гиони, в Proceedings of SPIE, Vol. 8631 (SPIE, Сан-Франциско, Калифорния, США, 2013) стр. 86311D.
↵
↵
↵
↵
↵
R. a. Колайер, Г. Скалиа, Ф. а. Villa, F. Guerrieri, S. Tisa, F. Zappa, S. Cova, S. Weiss и X. Michalet, in Proceedings of SPIE, Vol. 7905 (SPIE, Сан-Франциско, Калифорния, США, 2011), стр. 7
–7
–8.
С. Бурри, Ф. Повольни, К. Брускини, Х. Мишале, Ф. Регаццони и Э.Чарбон, в Proceedings of SPIE, Vol. 9141 (SPIE, Брюссель, Бельгия, 2014) стр. _9.
↵
↵
К. Брускини, Х. Хомулле и Э. Чарбон, in Proceedings of SPIE, Vol. 10069 (SPIE, Сан-Франциско, Калифорния, США, 2017) стр. 100691S.
↵
A. Ingargiola, P. Peronio, E. Lerner, A. Gulinatti, I. Rech, M. Ghioni, S. Weiss и X. Michalet, in Proceedings of SPIE, Vol. 10071 (SPIE, Сан-Франциско, Калифорния, США, 2017) стр.100710Q.
↵
↵
↵
↵

Колонка: Глубокие мысли из глубин чащи — Мнение — Waxahachie Daily Light

Часто остроумная, а иногда и верная поговорка о яблоках, падающих прямо с деревьев. Вряд ли это относится к дяде Морту и его младшему брату Баду, который живет еще глубже в зарослях. Они такие же противоположности, как оладьи и блины.

В то время как Морт взволнован 24 часа в сутки, 7 дней в неделю, Бад спокоен, хладнокровен и собран и оживает на самой низкой передаче.Обычно предпочитает тишину разговору, Бад — одно из немногих слов. Когда он действительно говорит, его слова хорошо подобраны и полезны на века. Его дети очень близко относятся к буддизму, регулярно их цитируют. А его пятеро внуков в возрасте от 8 до 26 лет могут читать их по желанию. (Они даже пронумеровали их, чтобы сэкономить время.)

К сожалению, многие посетители чащи не обходят стороной чушь дядюшки Мортса, когда ищут дорогу к дому Бадса, поэтому его тихая мудрость редко появляется в печати.

Убежденные, что сегодня дети живут в эпоху прав и возможностей получать то, что они хотят, и когда они этого хотят, с лентами участия для всех. Буд вытаскивает того, кто сказал, что жизнь — это справедливый бромид.У его детей были домашние дела.

Я помню, как его младший сын признался, что не хотел убирать гараж в одну субботу, как было сказано. День был жаркий, и в 16 лет ручной труд не привлекал внимания. «Ты недостаточно большой, чтобы меня больше делать», — хвастался он.

Вы правы. «Я не достаточно большой, чтобы сделать тебя, но Я достаточно большой, чтобы заставить тебя ЖЕЛАТЬ, что ты это сделал», — улыбнулся Бад, болтая ключи от машины, которые подросток надеялся забрать на вечер. (Кроме того: гараж был безупречно чист за короткое время.)

У Бада и его жены был простой подход к воспитанию детей.У них есть двое взрослых сыновей, которые применяли часто повторяемые отцами советы по воспитанию детей: любите им головы и шлепайте по заднице чаще, чем вторым.

Оба искренне дорожат своими отцами. Я люблю тебя, и я горжусь твоими комментариями, искренне высказанными по сей день.

Они знают, что он имеет в виду каждое слово, и что они никогда не слишком стары, чтобы обнять своего папу.

Будизм распространяется не только на воспитание детей, но и на игровые столы.

Заядлый игрок, он пытается держать домино в движении с его долгой мыслью, ошибочной философией.

Он цитирует эту фразу своему партнеру и оппонентам, а также свободно дает этот совет: Если вам не удается домино, сделайте ставку.

Он никогда особо ни о чем не беспокоился. Он дает утешительный совет, когда его жена беспокоит, покупать ли то или это. Его девиз: Потрать немного и немного сэкономить.

Однажды он разговаривал с другом, который хотел купить грузовик с колесной формулой 4х4. Дядя Бад спросил его, сколько времени, по его мнению, он на самом деле использует функцию 4×4.«Может быть, в 10% случаев», — ответил его друг.

Вам не нужно планировать 10 процентов своего времени, — предложил Бад. Опять тихая мудрость.

Его советы мужьям неподвластны времени. Он ветеран в браке, сейчас в браке 58 лет. «Ты можешь быть прав, а можешь быть счастлив», — шутит он.

Шутя в сторону, он и его жена олицетворяют удачный брак. Это громкое и ясное сообщение, важное для людей, которые никогда не отваживаются заглядывать в заросли.

Практикующий древнюю религию, Бад утверждает, что Господь может использовать любую ситуацию для Своего блага.Так на самом деле, из-за чего нужно злиться?

Мы коснулись, но немногих буддистов подобрали за эти годы.